细菌细胞的三维成像，实现精确的细胞表现和精确的蛋白质定位

1. 样品制备 使大肠杆菌荧光成像，无论是工程他们表达细胞质荧光蛋白6或使用膜染料5。其他细菌种类可以使用代替大肠杆菌。 通过电穿孔对细胞进行编码，该质粒编码细胞质mCherry荧光蛋白，通过电穿孔转换细胞。注：可以使用其他颜色的不同荧光蛋白。 在37°C下用适当的抗生素在LB板上生长转化剂。获得单菌落，并通过显微镜识别阳性克隆。在显微镜下出现红色的抗生素耐药菌落含有携带mCherry的质粒。 在摇动的培养箱中，在37°C下用适当的抗生素在LB液体培养基中生长2 mL。使用从盘子或少量冰柜库存的菌落作为接种。注：使用为实验选择的细菌细胞所需的介质。 将隔夜培养1：1，000培养成5 mL的新鲜LB培养基，让细胞在摇动培养箱中以37°C生长成指数相，持续3⁄4小时。 测量细胞的OD600，确认它们处于指数相（即。，OD600 = 0.2_0.4）。注：成像可以在任何生长阶段执行，具体取决于所执行的实验。 2. 幻灯片准备 注：使用自荧光低的介质非常重要。任何具有低自荧光的介质都可以使用。在本实验中，需要1%的甘蔗M63最小介质垫和用VaLaP19密封才能在3D中成像细胞。 在 20 mL 的最小介质中制备 1% 的甘蔗溶液。 微波溶液，直到甘蔗完全溶解，溶液看起来清晰。 将溶液保存在60°C水浴中，直到随时使用。注：此溶液可根据需要进行凝固和熔化，也可以被少量异量熔化，并根据需要熔化。多次使用后，介质可能会变色，应更换。 在 80~100 °C 的热板上熔化 VaLaP 密封剂。注：将 50 g 的石油果冻、羊毛脂和石蜡分别熔化在 80~100°C 的热板上的烧杯中，制备 VaLaP，用作密封剂。大量的 VaLaP 可以无限期地在室温下存储，足以用于 >500 张幻灯片。在 >100 °C 下加热会导致其降解，其颜色将变暗。 将三个 20 mm x 20 mm 盖玻片各两个堆栈放在幻灯片的两端（六个总盖玻片）。 将200 μL的甘蔗垫溶液移液到幻灯片上。注：如果不使用工程荧光染色剂，可以在此步骤之前将膜染料添加到甘蔗垫溶液中。将染料重新悬浮在水中，并将染料添加到 1 mL 的甘蔗甘草垫溶液中，最终浓度为 5 μg/mL。 立即牢固地将第二张滑轨放在盖玻片上，将琼脂压平，并在室温下凝固 1 分钟。 小心地滑下顶部幻灯片。 使用 200 μL 移液器尖端的大端从滑道上的凝胶（直径约 5 mm）切出单个焊盘，并丢弃变形或不需要的凝胶。注：如果成像多个菌株或条件，每个菌株需要单独的垫。如果只对一个应变进行成像，则制作 3⁄4 垫以帮助支撑盖玻片。 移液细胞上下多次破坏细胞团块，并确保培养液很好地混合。移液器 1 μL 的亚文化从步骤 1.3 到垫上。注：细胞形状重建需要不接触其他细胞的单个细胞。如果使用固定相或高细胞密度培养物，可能需要在将样品放在焊盘上之前稀释样品 1：10。 让样品空气干燥5~10分钟。确保水滴完全吸收到垫子中。如果任何液体仍然存在，细胞将在液体中移动，无法成像。 将盖滑放在垫盘顶部。 用融化的 VaLaP 轻轻刷绕盖滑道边缘，用棉签密封盖滑。确保使其远离目标将触及的盖玻片顶部。VaLaP 会在几秒钟内变硬，密封样品。 立即对示例进行映像。注：一旦准备幻灯片，就应对示例进行成像。细胞可以在垫子上生长，如果它们分裂重建将更加困难。 3. 成像要求 确保显微镜的 z 或对焦轴能够进行小于 50 nm 的精确运动。使用 z 压电级（参见材料表），可用于研究级显微镜，因为典型的电动对焦设备无法提供这种精度。注：假设奈奎斯特-山农采样标准为20，需要能够移动0.5倍所需的最小步长大小，或2倍所需的空间频率。对于该协议所需的 100 nm 步长，需要精度为 50 nm 或以下的阶段。 确保显微镜包含 100 倍物镜，最小数值孔径 （NA） 为 1.45。 收集 200-400 个不同单元之间的 z 堆栈，以确保为下游应用获得足够的单元。注：所需的细胞数量取决于感兴趣样本的基本变异性。此时收集的一些单元格无法通过重建步骤。 如果测量二次荧光通道（蛋白质、代谢标签等），确保 z-stack 与形状通道的设置相匹配。 4. 成像 将密封的幻灯片插入显微镜，使其坐5分钟，使温度与周围环境平衡，因为显微镜室的温度可能与样品制备室的温度不同。 取样品的荧光z堆栈。注： z 堆栈应完全覆盖小于景深的 z 间距。对于 1.45 NA 100x 目标和 ±1 μm 厚的大肠杆菌细胞，每步 100 nm 处 40 步可正常工作。对于表面上不完全平坦的较大细胞或细胞，可能需要 50 个或更多步骤。包括足够的步骤，并确保样品在上方和下方完全模糊。 使用与显微镜相关的软件（参见材料表）来控制显微镜。 使用显微镜聚焦轮聚焦细胞中间。在ND 采集下，选中 Z框以采用 z 堆栈。单击”主页”按钮将单元格的中间设置为起点。将步长大小设置为 0.1 μm 并将范围设置为 4 μm。确保 Z 设备设置为压电阶段。 将Lambda 窗口下的荧光通道设置为正在成像的荧光分子的设置。在这个实验中使用了GFP和mCherry。注：如果需要附加荧光通道的 3D 分布，在第二个颜色通道中采用具有相同步长大小和范围的附加 z 堆栈。在这个实验中，细胞质mCherry用于确定细胞形状，MreB-GFP用作第二色通道21。 确保实验顺序设置为 lambda（z 系列），以便在切换之前在每个颜色通道中采用完整的 z 堆栈。 单击”立即运行”以启动图像采集并保存文件，其中一个或两个 z 堆栈已完成。 移动到焊盘上的新区域，然后重复步骤 4.2.2-4.2.5。 5. 细胞重建 裁剪单个单元格并将图像另存为堆叠的 tiff 文件，以便每个文件只有一个单元格。确保此单元格与任何其他单元格完全隔离（即，xy 中模糊功能的全宽半最大值约为 5 倍）。注：这可以使用免费的图像分析软件完成（见材料表）。 在单个单元格周围绘制一个框，并复制该单元格 2x，每个通道复制一次。确保选中重复的超堆栈框，并将通道更改为 1 或 2，确保切片包含整个 z 堆栈。注：如果成像只有细胞的形状，而不是额外的荧光蛋白，将只存在一个通道。 两个堆栈都可用后，转到映像 |堆栈 |工具 |串联，将图像与蛋白质通道第一和形状通道第二结合。 将新映像另存为 tiff 文件。 测量显微镜的模糊功能使用亚衍有限荧光珠22。这需要为每个显微镜和显微镜物镜进行，但可以在成像感兴趣的样品之前或之后进行。 使用可用软件手动干预，将多个独立磁珠平均在一起（参见材料表）。注：最终产品应该是模糊函数的 3D 图像，其 xyz 间距应与感兴趣的样本相同。 使用可用软件运行正向卷积单元形状重建脚本。这些脚本的最新版本可以从https://github.com/PrincetonUniversity/shae-cellshape-public免费下载。 在桌面上的文件夹中创建一个文件夹，其中包含裁剪后的图像和来自 shae-cell-xshape-public/exampleData_tri 的单元格_shape_settings_tri.txt文件。 编辑单元格_形状_设置_tri.txt，以具有感兴趣的实验的正确设置。对于此实验，设置文件包括以下行：纳米=每像素 70Z_比例 0.65堆栈_z_大小 41堆栈_t_大小 1Fstack_z_size 41Fstack_t_大小 1堆栈_分化\nm 100Fstack_seperation_nm 100psfScript -999 osuPSF20180726渐变 1注：此文本文件被组织成多个部分，每个部分被解析为自己的变量。虽然许多设置不需要从实验更改为实验，但应确保 z 堆栈的大小（形状为stack_z_size，Fstack_z_size为感兴趣的蛋白质），z 堆栈的间距（堆栈_seperation_________________）的间距nm， Fstack_seperation_nm），显微镜的相对焦移（Z_scale）23，xy 的像素大小（nm_per_像素），以及加载显微镜模糊功能的脚本名称（psfScript） 匹配实验。如果形状通道是细胞质填充的，则梯度场应设置为 1;如果是膜染色对象，则梯度场应设置为 0。 运行Cell_shape_探测器3dConvTriFolder函数（shae-cellshape-public/CellShapeDetectorTri/），将字符串与文件夹位置后跟要启动的单元格数以及要运行的单元格数。注：输入的示例如下所示：Cell_shape_探测器3dConvTriFolder（”带有裁剪图像的文件夹的路径”，文件夹中的起始索引，单元格的 *）。一个典型的细胞可能需要5~20分钟，重建才能收敛和完成。 在使用单元格进行任何统计分析之前，筛选单元格重建，以确保它们正确无误。 运行ScreenFits（shae-cell 形状-公共/shae-fitViewerGui/），以可视方式筛选单个单元格重建。 打开图形用户界面 （GUI） 时单击”选择文件夹”按钮，然后选择在步骤 5.3 中创建的重建数据文件 （TRI.mat） 的文件夹。 如果单元格出现畸形或未完全收敛，请选择单元格重建旁边的框（图 3）。这可能看起来像一个带孔的细胞，一个平坦的一面，或者一个分支从它出来。这将在文件名中附加”FLAG”，以便可以从任何下游分析中排除它。注：重建的单元格可以与原始图像进行比较。如果您的细胞来自各种形状异构群体，这一点尤其重要。 运行浓缩平滑Spline（shae-cell形状-公共/），以创建感兴趣的蛋白质的相对浓度的富集轮廓，作为高斯曲率在表面的函数。 选择在步骤 5.3.3 中创建的 TRI.mat 文件的每个文件夹。 选择新创建的 （5.5.1） 曲线.mat 文件。注：将为 5.5.1 中选择的每个文件夹创建一个 curve.mat 文件。所有扩充配置文件都将显示在一个图形上。如果每个文件夹需要单个图形比运行 5.5。注：除了荧光蛋白的精确几何定位外，还有许多其他方法可以分析来自二次通道的数据，包括计算对象4的数量、大小和方向。