التصوير ثلاثي الابعاد للخلايا البكتيرية للتمثيلات الخلوية الدقيقة وتعريب البروتين الدقيق
Summary
يشرح هذا البروتوكول كيفيه اعداد وتركيب العينات البكتيرية للتصوير الحي ثلاثي الابعاد وكيفيه أعاده بناء الشكل ثلاثي الابعاد من كولاي من تلك الصور.
Abstract
شكل البكتيريا مهم لعلم وظائف الجسم. يمكن ان يتاثر العديد من جوانب فسيولوجيا الخلية مثل حركيه الخلية ، والنهب ، وإنتاج بيوفيلم بشكل الخلية. الخلايا البكتيرية هي الكائنات ثلاثية الابعاد (3D) ، علي الرغم من انها نادرا ما تعامل علي هذا النحو. تؤدي معظم تقنيات المجهر إلى صور ثنائيه الابعاد (ثنائيه الابعاد) تؤدي إلى فقدان البيانات المتعلقة بشكل الخلية ثلاثية الابعاد الفعلي وتوطين البروتينات. بعض المعلمات الشكل ، مثل انحناء غاوسي (المنتج من التقوسات الرئيسية اثنين) ، يمكن فقط ان تقاس في 3D لان الصور 2D لا تقيس كل من تقوسات الرئيسية. بالاضافه إلى ذلك ، لا تقع جميع الخلايا مسطحه عند التركيب والتصوير ثنائي الابعاد للخلايا المنحنية قد لا تمثل بدقه اشكال هذه الخلايا. يمكن ان يساعد قياس توطين البروتين بدقه في 3D علي تحديد التنظيم المكاني ووظيفة البروتينات. وقد تم تطوير تقنيه التواء الاماميه التي تستخدم وظيفة طمس من المجهر لأعاده بناء الاشكال الخلية 3D وبدقه توطين البروتينات. هنا ، يتم وصف بروتوكول لاعداد وتركيب عينات لتصوير الخلايا الحية من البكتيريا في 3D علي حد سواء لأعاده بناء شكل خليه دقيقه وتوطين البروتينات. ويستند هذا الأسلوب علي اعداد عينه بسيطه ، واكتساب صوره الفلورسنت ، ومعالجه الصور المستندة إلى MATLAB. يمكن تعديل العديد من المجاهر الفلورية عاليه الجودة ببساطه لاتخاذ هذه القياسات. هذه أعاده بناء الخلايا هي مكثفه حسابيا والوصول إلى الموارد الحاسوبية عاليه الانتاجيه ويوصي ، وان لم يكن ضروريا. وقد تم تطبيق هذه الطريقة بنجاح علي العديد من الأنواع البكتيرية والمسوخ ، وطرائق التصوير الفلوري ، ومصنعي المجهر.
Introduction
الخلايا من جميع الأنواع تنظيم الاشكال الخاصة بهم لوظائف محدده. علي سبيل المثال ، تتشكل الخلايا العصبية بطريقه مختلفه عن كريات الدم ولها وظائف مختلفه. المثل ، تاتي الخلايا البكتيرية في مجموعه متنوعة من الاشكال والاحجام ، علي الرغم من ان الغرض من هذه الاشكال لا يعرف دائما1،2. ولذلك ، فمن المهم ان يتم تحديد شكل الخلايا البكتيرية بدقه. توضح الطريقة الموضحة طريقه سهله التنفيذ لجمع البيانات المناسبة للتحليل ثلاثي الابعاد لمعظم الخلايا البكتيرية الحية أو الثابتة.
الطريقة الموصوفة تمكن المرء من التقاط صور ثلاثية الابعاد للخلايا البكتيرية من أجل تمثيل شكل الخلية ثلاثية الابعاد بدقه في العينة وتحديد البروتينات داخل هذه الاشكال بدقه. التقنيات المجهرية التقليدية تاخذ الصور 2D ، والتي هي إشكاليه عند دراسة الخلايا التي لها اشكال غير طبيعيه أو غير متناظرة ، مثل طفرات القولونية، أو البكتيريا المنحنية مثل الكوليرا والملوية بيلوري. في حين ان الصور ثلاثية الابعاد ذات الدقة العالية هي المدخل الرئيسي لهذا الأسلوب ، فان الأسلوب لا يرجع صوره محسنه للقرار. بدلا من ذلك ، هذا الأسلوب يعيد إنشاء إحداثيات السطح ثلاثي الابعاد وشكل الخلية باستخدام خوارزميه التواء إلى الامام باستخدام المعالم النشطة ووظيفة ضبابية واضحة للمجهر3 (الشكل 1). وقد استخدمت لدراسة البكتيريا الاكتين homolog mreb في e. القولونية4,5,6,7, الرواية periskeletal عنصر crva في كوليرا8, والمفترض bactofilin CcmA في الملوية بيلوري9 (الشكل 2).
يمكن لتوطين البروتينات إعطاء نظره ثاقبه في وظائفهم. علي سبيل المثال ، البروتينات المشاركة في تقسيم الخلايا عاده ما تكون مترجمه إلى الخلية الوسطي10،11. وقد أجريت دراسات عاليه الانتاجيه لتوطين جميع البروتينات من بكتيريا علي أمل الحصول علي نظره ثاقبه في وظائفهم12. لسوء الحظ ، تم اجراء هذه الدراسات مع التصوير 2D و 1D أو 2D التحليل ، مما يجعل من المستحيل لقياس جوانب محدده من توطين البروتين ، مثل التعريب إلى الميزات الهندسية الخلوية.
علي سبيل المثال ، يتم الافتراض بان البروتين الديناميكي المطلوب لشكل قضيب العديد من البكتيريا ، للعمل عن طريق توجيه توطين الخلية التوليف الجدار ، والتعريب لها الترجمة التعريب جدار الخلية التوليف7،13. الملوخية من أنواع متعددة يظهر الإثراء الهندسي4،6،7،14،15. البوليمرات السطحية الديناميكية ، مثل MreB ، قد زوجين هندسه السطح إلى الوقت المتوسط تخصيب الملف الشخصي16 وقد تكون قادره علي توجيه لهندسي محدده عن طريق التقليل من الطاقة المرتبطة بالربط إلى الغشاء17. في حين ان اهميه التواء ، والتجميع ، والانحناء ، والديناميكية لم يتم حلها بالبالكامل بالنسبة لشركه MreB ، من المهم ملاحظه ان القياسات الدقيقة لتقوسات الرئيسية للسطح تتطلب تمثيلا كاملا ثلاثي الابعاد للخلية. ولذلك ، لقياس أكثر دقه تقوسات التي البروتينات تعريب ، فمن التفضيلية لاستخدام 3D ، بدلا من التصوير 2D. التصوير ثلاثي الابعاد يلغي الحاجة إلى التقدير الحسابي لتلك التقوسات التي لا يمكن قياسها في 2D ، وهو تقدير قد لا يكون دقيقا في الخلايا غير المتناظرة18.
علي الرغم من ان التصوير ثنائي الابعاد للخلايا أسرع ولا يتطلب قدرا كبيرا من العمل الحسابي ، فان التصوير ثلاثي الابعاد يوفر تمثيلا أدق للخلية ، فضلا عن القدرة علي قياس الخصائص السطحية ، مثل الانحناء ، والتي لا يمكن قياسها في 2D. ولذلك ، كما يصبح التصوير ثلاثي الابعاد أكثر شيوعا ، سيصبح من الممكن رؤى جديده في شكل الخلية وتوطين البروتين.
Protocol
Representative Results
Discussion
ومن الخطوات الحاسمة في هذا البروتوكول الحصول علي صور عاليه الجودة. لأعاده بناء الخلايا بشكل صحيح ، يجب ان يكون هناك ما يكفي من عدم الوضوح فوق وتحت الخلية. ولذلك ، فانه من الضروري ان المكدس z المتخذة يغطي مسافة كبيره بما فيه الكفاية. يمكن تعديل عدد الخطوات المتخذة اثناء الحصول علي الصورة لكل سلاله. علي سبيل المثال ، الخلايا e. القولونية المحذوفة ل rodz هي أوسع وتتطلب المزيد من الخطوات ، التالي ، مسافة أكبر من الخلايا نوع البرية. إذا كانت العينة الانجرافات اثناء اكتساب الصورة ، وأعاده الاعمار يمكن ان يكون لها أخطاء كبيره. ولذلك ، فمن المهم ان ندع الشريحة تاتي إلى التوازن الحراري مع المجهر قبل التصوير لتجنب الانجراف خلال اكتساب z-كومه. يجب ان تكون الخلايا غير المصابين علي منصات مع انخفاض الفلورية. مكونات الوسائط ، مثل تلك الموجودة في متوسط LB الشائعة ، لها الفلورية التي يمكن ان تسبب مشاكل عند محاولة أعاده بناء الخلايا. كثافة الخلايا علي لوحه التصوير مهم لان عمليه أعاده البناء يتم تنفيذها بشكل مستقل علي كل خليه. عدد قليل جدا من الخلايا سوف تزيد من الوقت اللازم للحصول علي صور لعدد كاف من الخلايا ، في حين ان العديد من الخلايا سوف يؤدي إلى حقول التصوير التي هي كثيفه جدا لزراعه الخلايا الفردية بسهوله. ونظرا لعدم أعاده بناء جميع الخلايا بشكل صحيح ، ينبغي ان تكون الخلايا الاضافيه غير موجودة اثناء مرحله الاقتناء وينبغي فرز جميع النواتج قبل المضي قدما في التحليل الإحصائي (الشكل 3).
العديد من القيود لهذه الطريقة التقنية. علي المجهر لاستخدامها ، يجب علي المرء ان يكون الهدف الذي لديه فتحه رقميه عاليه (عاده > 1.4) ، لان هذا يتيح التقطيع البصرية علي نطاق حجم البكتيريا. بالاضافه إلى ذلك ، يجب ان تكون مجهزه المجهر مع مرحله بيزو التي يمكن ان تتخذ خطوات صغيره ودقيقه في الاتجاه z. وعلاوة علي ذلك ، في حين انه ليس من الضروري ، ينصح بشده الوصول إلى الموارد الحسابية عاليه الانتاجيه لتشغيل برنامج تحليل الصور لأنه سيتم تقليل وقت المعالجة لأعاده بناء الخلايا.
أحد القيود المفاهيمية للأسلوب هو انه يجب اختيار موازين الطاقة الصحيحة لترجيح نعومه البناء بالنسبة لمعدل الاشاره إلى الضوضاء للصور. للتحقق من اختيار المعلمات ، يجب قياس احجام واشكال الخلايا باستخدام أساليب مستقله مثل المجهر الكترون الإرسال (TEM) أو المجهر القوه الذرية (فؤاد). وكدليل علي المبدا ، تم اجراء أعاده بناء الخلايا ثلاثية الابعاد اما علي فؤاد لاختبار دقه z (< 50 نانومتر) أو علي شبكه TEM لاختبار دقه xy (< 30 نانومتر)3. وهذا النهج المترابط يستغرق وقتا طويلا ومكلفا. وقد يكون النهج الأبسط لصوره عينات قياسيه مثل الخلايا نوع البرية أو 1 μm الخرز كرويه. ويمكن استخدام القطر والكروية لأعاده البناء لضمان صحة الحجم وموازين الطاقة المستخدمة في أعاده الاعمار.
هذه ليست الطريقة الوحيدة التي تسعي لاستخراج المعلومات المكانية عاليه الدقة من الصور المجهرية الفلورية. العديد من المقالات الاستعراضية تصف التطورات الاخيره في مجال المجهر الفائق24،25. تقنيات تعزيز القرار مثل تفكيك المجهر26، الغزل القرص المجهر البؤري27، أعاده تعيين بكسل28، والمجهر الاضاءه المهيكلة (SIM)29 تسعي لتحسين القرار من صور التي حصلت عليها المجهر. وهذه الأساليب لا تتنافى مع النهج المقدم. مؤخرا تم تكييف هذه الطريقة للسماح للصور المستندة إلى SIM كمدخلات9. في حين ان طريقه التواء إلى الامام تشترك في بعض الدعائم مع المجهر غير الحلزوني ، فانه يحتوي علي مخرجات مختلفه تماما. في حين ان النهج مثل تفكيك المجهر تسعي إلى تحسين القرار من الصورة ، وهذا النهج لا تولد صوره ولكن بدلا من أعاده بناء شكل خليه مع دقه 50 نانومتر تقريبا. ويمكن لتقنيات المجهر النشط أحاديه الجزيء التي تعتمد علي عينات قليله التسمية ان توفر مستويات اعلي من الدقة المكانية من هذه الطريقة. في كثير من الحالات ، وهذه النهج جزيء واحد يتطلب الاستفادة المثلي من ثوابت الفلورسنت ويمكن ان تتطلب وقتا طويلا الاستحواذ ، مما يجعلها صعبه الاستخدام مع عينات حيه أو ديناميكية. كل من هذه الطرق ياتي مع تحذير واحد أو أكثر ان هذا الأسلوب لا. علي سبيل المثال, الفوائد المعلن عنها من قبل الغزل القرص المجهر البؤري ليست كما تنطبق علي أحاديه الخلايا البكتيرية, حيث لا يوجد الكثير من ضوء الطائرة. وعلاوة علي ذلك ، يوفر هذا الأسلوب خط أنابيب للحصول علي الاشكال الخلية 3D دقيقه وتوطين البروتين دون الحاجة إلى اي فلوبهورس المتخصصة. هذا الأسلوب لديه الحد الأدنى من متطلبات الاجهزه (اي ، z بيزو ، عاليه الهدف NA) ويتطلب سوي عشرات الصور في الوقت الواحد ، مما يسمح للمرء ان التحقيق بسهوله الهياكل 3D ديناميكية6.
وهناك عدد متزايد من النهج لدراسة تنظيم الخلايا البكتيرية في الهياكل ثلاثية الابعاد. وتشمل هذه النهج المفاهيمي مماثله لهذه التي تستفيد من جوده عاليه, 3d الصور الفلورية30,31,32. يتطلب هذا النهج خلايا معزولة جيدا ولا يجعل الافتراضات المسبقة حول الهندسة الخلوية. ومع ذلك ، للانتقال إلى المجاميع الخلوية الكثيفة أو الاغشيه البيولوجية ، يفترض ان تكون الخلايا مثل قضيب. يتيح هذا العرض الأقل دقه امكانيه التحقق من ترتيبات التعبئة للخلايا ، علي الرغم من ان الكثافة العالية للخلايا في البيوفيلم تمنع تحليل التعريب الخلوي لعوامل محدده.
في المستقبل ، قد يكون من المثير للاهتمام لوضع اطار لدمج جزيء واحد ونهج واسعه المجال مع هذه التقنية 3D أعاده البناء. وعلاوة علي ذلك ، قد يكون من الممكن ادراج هذا النهج التواء إلى الامام مع أدوات تقسيم الرؤية اليه32 للسماح باعاده بناء مجموعات خلايا أكثر كثافة.
لماذا تطورت الخلايا إلى اشكال محدده هي قضية معقده يجب ان تعكس البيئة المعقدة التي يعيشون فيها. يتطلب فهم تطور ووظيفة اشكال الخلايا أخذ قياسات دقيقه ودقيقه لتلك الاشكال ، وهو ما يوفره هذا الأسلوب.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونود ان نشكر جيفري نغوين وجوشوا شاهيفيتز للمساعدة في تطوير هذه الطريقة.
التمويل: RMM-المعاهد القومية للصحة F32 GM103290-01A1 ، BPB-مركز غلين للبحوث الشيخوخة ومؤسسه العلوم الوطنية في 1734030.
Materials
| 50nm fluorescent beads | Invitrogen | F8795 | these are used to measure the blurring function of the microscope |
| Agarose | sigma-Aldrich | A9539 | |
| Cotton Swab | Puritan Medical Products Company LLC | S304659 | used to appy VaLaP |
| Cover Slips | VWR | 16004-302 | |
| Fiji | ImageJ | https://fiji.sc | used to cro cells |
| FM4-64 | Invitrogen | LST3166 | membrane dye used to stain cells |
| Huygens Software | Scientific Volume Imaging | Huygens essential or professional | Use to measure blurring function of microscope |
| Lanolin | Sigma-Aldrich | L7387 | combine with paraffin and petroleum jelly to make VaLaP |
| LB growth medium | BD Difco | DF0446173 | |
| M63 medium | US Biological | M1015 | |
| MATLAB | Mathworks | Needed to run forward convolution scripts | |
| Microscope Slides | Fisher | 12-550-133 | |
| NIS Elements | Nkon | ||
| Paraffin | Sigma-Aldrich | 327212 | |
| Petroleum Jelly | Equate | 49035-038-27 | |
| piezo z stage | Nikon | 77011589 | |
| pipet tips -p200 | USA Scientific | 1111-0730 | |
| pipet tips- p10 | USA Scientific | 1111-3730 |
References
- Young, K. D. The Selective Value of Bacterial Shape. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 70 (3), 660-703 (2006).
- Persat, A., Stone, H. A., Gitai, Z. The Curved Shape of Caulobacter crescentus Enhances Surface Colonization in Flow. Nature Communications. 5, 3824 (2014).
- Nguyen, J. P., Bratton, B. P., Shaevitz, J. W., Hong, H. J. . Bacterial Cell Wall Homeostasis: Methods and Protocols. , 227-245 (2016).
- Bratton, B. P., Shaevitz, J. W., Gitai, Z., Morgenstein, R. M. MreB Polymers and Curvature Localization are Enhanced by RodZ and Predict E. coli’s Cylindrical Uniformity. Nature Communications. 9 (1), 2797 (2018).
- Ouzounov, N., et al. MreB Orientation Correlates with Cell Diameter in Escherichia coli. Biophysical Journal. 111 (5), 1035-1043 (2016).
- Morgenstein, R. M., et al. RodZ links MreB to Cell Wall Synthesis to Mediate MreB rotation and Robust Morphogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences. , 12510-12515 (2015).
- Ursell, T. S., et al. Rod-Like Bacterial Shape is Maintained by Feedback Between Cell Curvature and Cytoskeletal Localization. Proceeding of the National Academy of Science U.S.A. 111 (11), E1025-E1034 (2014).
- Bartlett, T. M., et al. A Periplasmic Polymer Curves Vibrio cholerae and Promotes Pathogenesis. Cell. 168 (1-2), 172-185 (2017).
- Taylor, J. A., et al. Distinct Cytoskeletal Proteins Define Zones of Enhanced Cell Wall Synthesis in Helicobacter pylori. bioRxiv. , 545517 (2019).
- Egan, A. J. F., Vollmer, W. The Physiology of Bacterial Cell Division. Annals of the New York Academy of Science. 1277 (1), 8-28 (2013).
- Adams, D. W., Errington, J. Bacterial Cell Division: Assembly, Maintenance and Disassembly of the Z ring. Nature Reviews Microbiology. 7 (9), 642-653 (2009).
- Werner, J. N., Gitai, Z., Melvin, I. S., Brian, R. C., Alexandrine, C. High-Throughput Screening of Bacterial Protein Localization. Methods in Enzymology. 471, 185-204 (2010).
- de Pedro, M. A., Quintela, J. C., Höltje, J. V., Schwarz, H. Murein Segregation in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 179 (9), 2823-2834 (1997).
- Hussain, S., et al. MreB Filaments Align Along Greatest Principal Membrane Curvature to Orient Cell Wall Synthesis. eLife. 7, e32471 (2018).
- Wong, F., et al. Mechanical Strain Sensing Implicated in Cell Shape Recovery in Escherichia coli. Nature Microbiology. 2, 17115 (2017).
- Wong, F., Garner, E. C., Amir, A. Mechanics and Dynamics of Translocating MreB Filaments on Curved Membranes. eLife. 8, e40472 (2019).
- Quint, D. A., Gopinathan, A., Grason, G. M. Shape Selection of Surface-Bound Helical Filaments: Biopolymers on Curved Membranes. Biophysical Journal. 111 (7), 1575-1585 (2016).
- Colavin, A., Shi, H., Huang, K. C. RodZ Modulates Geometric Localization of the Bacterial Actin MreB to Regulate Cell Shape. Nature Communications. 9 (1), 1280 (2018).
- Shannon, C. E. Communication in the Presence of Noise. Proceedings of the IRE. 37 (1), 10-21 (1949).
- Billings, G., et al. De Novo Morphogenesis in L-Forms Via Geometric Control of Cell Growth. Mol Microbiol. 93 (5), 883-896 (2014).
- . Measuring a Point Spread Function Available from: https://www.ibiology.org/talks/measuring-a-point-spread-function (2012)
- Bratton, B. P., Shaevitz, J. W. Simple Experimental Methods for Determining the Apparent Focal Shift in a Microscope System. PLOS ONE. 10 (8), e0134616 (2015).
- Moerner, W. E., Shechtman, Y., Wang, Q. Single-molecule Spectroscopy and Imaging over the decades. Faraday Discussions. 184, 9-36 (2015).
- Sahl, S. J., Hell, S. W., Jakobs, S. Fluorescence Nanoscopy in Cell Biology. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18, 685 (2017).
- Sarder, P., Nehorai, A. Deconvolution Methods for 3-D Fluorescence Microscopy Images. IEEE Signal Processing Magazine. 23 (3), 32-45 (2006).
- Oreopoulos, J., Berman, R., Browne, M., Waters, J. C., Wittman, T. . Methods in Cell Biology. 123, 153-175 (2014).
- Huff, J. The Airyscan detector from ZEISS: confocal imaging with improved signal-to-noise ratio and super-resolution. Nature Methods. 12, 1205 (2015).
- Gustafsson, M. G. L. Surpassing the Lateral Resolution Limit by a Factor of Two Using Structured Illumination Microscopy. Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
- Lee, M. K., Rai, P., Williams, J., Twieg, R. J., Moerner, W. E. Small-Molecule Labeling of Live Cell Surfaces for Three-Dimensional Super-Resolution Microscopy. Journal of the American Chemical Society. 136 (40), 14003-14006 (2014).
- Yan, J., Sharo, A. G., Stone, H. A., Wingreen, N. S., Bassler, B. L. Vibrio cholerae Biofilm Growth Program and Architecture Revealed by Single-Cell Live Imaging. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (36), E5337-E5343 (2016).
- Wang, J., et al. Bact-3D: A level set segmentation approach for dense multi-layered 3D bacterial biofilms. 2017 IEEE International Conference on Image Processing (ICIP). , 330-334 (2017).
