Her beskriver vi metoden vi brukte for å avbilde svært aktive dendrittiske filopodia i en live forberedelse av Drosophila larvestadiet hjernen, og protokollen vi utviklet for å kvantifisere tidsforløp 3D bildedata sett for kvantitative vurderinger av dendrit dynamikk i å utvikle neurons.
Svært aktive dendrittiske filopodia er allment tilstede i neurons på tidlige utviklingsmessige stadier. Disse undersøkende dynamiske grener prøve det omkringliggende miljøet og initiere kontakter med potensielle Synaptic partnere. Selv om forbindelsen mellom dendrittiske gren dynamikk og synaptogenesis er godt etablert, hvordan utviklingsmessige og aktivitet-avhengige prosesser regulere dendrittiske grenen dynamikk er ikke godt forstått. Dette skyldes delvis tekniske problemer knyttet til live Imaging og kvantitative analyser av disse fine strukturene ved hjelp av et in vivo-system. Vi etablerte en metode for å studere dendrit dynamikk ved hjelp av Drosophila larvestadiet ventrale lateral neurons (LNvs), som kan være individuelt merket ved hjelp av genetiske tilnærminger og er tilgjengelig for Live Imaging. Utnytter dette systemet, utviklet vi protokoller for å fange grenen dynamikk av hele dendrittiske Arbor av en enkelt merket LNv gjennom time-lapse Live Imaging. Vi deretter utførte etterbehandling for å forbedre bildekvaliteten gjennom drift korreksjon og deconvolution, etterfulgt av analysere gren dynamikk på single-grenen nivå ved å kommentere romlige posisjoner på alle gren terminaler. Til slutt utviklet vi R-skript (tilleggsfil) og spesifikke parametre for å kvantifisere gren dynamikk ved hjelp av koordinat informasjonen som genereres av Terminal sporingen. Kollektivt, denne protokollen tillater oss å oppnå en detaljert kvantitativ beskrivelse av grenen dynamikk av neuronal dendrittiske Arbor med høy Temporal og romlig oppløsning. Metodene vi utviklet er generelt gjelder for tynt merket neurons i både in vitro og in vivo forhold.
Dendrites er spesialisert neuronal rom som mottar og behandler sensorisk og Synaptic innspill. Den komplekse og stereotype strukturen av dendrittiske arbors har vært under intens etterforskning siden oppdagelsen deres. En rekke modellsystemer, inkludert Xenopus optikk tectal neurons, chick retinal Ganglion celler, og dendrittiske arborization (da) neurons i Drosophila systemet, har blitt etablert for å studere utvikling, remodeling og plastisitet av neuronal dendrites1,2,3,4. Drosophila ventrale lateral neurons (LNvs) er en gruppe av visuell projeksjon neurons utgangspunktet identifisert for deres viktige funksjoner i døgn regulering av fly atferd5. Studier avslørte også rollen som larvestadiet LNvs som direkte postsynaptic målet for larvestadiet fotoreseptorene (PRs)6,7. Viktigere, dyrking utvikle larver i ulike lys regimer sterkt påvirker størrelsen på LNvs ‘ dendrittiske arbors, demonstrere egnetheten av LNvs som en ny modell for å studere dendrittiske plastisitet7. Nyere arbeid fra vår gruppe videre indikerer at både størrelsen på LNv dendrit og den dynamiske atferden til dendrittiske grener displayet Experience-avhengige plastisitet8,9. Som en del av dette arbeidet, utviklet vi en ny Live Imaging og kvantifisering protokoll for å utføre analyser på dendrit dynamikken i LNvs fra 2nd eller 3Rd skikkelsen larver.
Den gjennomsiktige natur Drosophila larvestadiet hjernen gjør det ideelt for Live Imaging. Imidlertid er den dendrittiske arbors av LNvs ligger i tett innervated larvestadiet optikk neuropil (LON) i sentrum av larvestadiet hjerne flik6. For å ta bilder av fine dendrit grener og filopodia i intakt hjernevev, bruker vi to-Foton mikroskopi, noe som øker dybden av lys penetrasjon og reduserer Phototoksisitet under Live Imaging eksperimenter10. Ved hjelp av dette oppsettet, vi vellykket utført Live Imaging eksperimenter på LNvs for over 30 min uten å observere åpenbare morfologiske forverring av Nevron. I tillegg genetisk manipulasjoner ved hjelp av flip-out teknikken gjorde oss i stand til å merke den enkelte LNvs med en membran merket GFP, som også er avgjørende for å overvåke bevegelsene til enkelte grener11,12,13 .
For å fange den dynamiske atferden til alle grener på LNv dendrittiske Arbor med optimal optisk oppløsning, utførte vi time-lapse 3D Imaging på fersk dissekert larvestadiet hjernen explants med en høy romlig oppløsning på 1 min per ramme for 10 til 30 min. utvikle LNv dendrites er svært dynamiske, med en stor prosentandel av grenene som viser merkbare endringer innenfor 10 min vinduet. Dette fører til en av de viktigste tekniske utfordringene i å studere dendrit dynamikk, kvantifisere gren atferd basert på 4D bildedata settene. Tidligere etablerte metoder har ulike begrensninger, inkludert mangel på nøyaktighet og overdreven tid kravet. Derfor har vi utviklet en semi-automatisk metode som kombinerer bilde etterbehandling, manuell merking av grenen terminaler, og automatisk 4D flekk sporing ved hjelp av et bilde merknad programvare. Vi beregner bevegelsene til gren terminaler på forskjellige tidspunkter basert på 3D-koordinatene til flekkene. Dataene eksporteres deretter og analyseres for å gi kvantitative målinger av gren dynamikken. Denne metoden vurderer nøyaktig varigheten og omfanget av forlengelse og tilbaketrekking hendelser av eksisterende grener, samt dannelsen av nye grener, slik at vi kan overvåke dendrit dynamikk i et stort antall neurons.
Her beskriver vi en protokoll vi utviklet for å spille inn og kvantifisere den dynamiske atferden til dendrittiske grener i individuelt merket neurons i Drosophila larvestadiet hjerner. Spesielt vår Live Imaging protokollen inneholder spesifikke parametre som gjør oss i stand til å fange hele dendrittiske Arbor av en larvestadiet LNv og gi en global visning av den dynamiske tilstanden til sine dendrit grener. Men, fordi våre kvantifisering metoder tungt avhengige av merknaden om gren terminaler, neurons med…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet er støttet av intramural Research program of National Institute of nevrologiske lidelser og hjerneslag, National Institutes of Health. Prosjektnummer 1ZIANS003137.
Chameleon Vision II multiphoton laser | Coherent | ||
high vacuum grease | Dow Corning | 79751-30 | |
LSM 780 two-photon laser scanning confocal microscope | Carl Zeiss | upright configuration | |
Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-544-E | |
Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
Software | |||
Excel | Microsoft | for processing .csv files | |
Huygens Professional | Scientific Volume Imaging | for drift correction and deconvolution | |
Imaris | Oxford Instruments | for 3D visualization and image annotation | |
Reagents | |||
Glucose | |||
HEPES | |||
KCl | |||
MgCl2 | |||
NaCl | |||
NaHCO3 | |||
PBS | |||
Sucrose | |||
TES |