Her beskriver vi den metode, vi anvendte til at afbilde meget motile sædceller dendritiske filopodia i en levende forberedelse af Drosophila larve hjernen, og den protokol, vi udviklede til at kvantificere tidsforskudt 3D imaging datasæt for kvantitative vurderinger af dendrit dynamik i udviklingen af neuroner.
Meget motile sædceller dendritiske filopodia er bredt til stede i neuroner på tidlige udviklingsmæssige stadier. Disse sonderende dynamiske grene prøve det omgivende miljø og indlede kontakter med potentielle synaptiske partnere. Selv om forbindelsen mellem dendritiske gren dynamik og synaptogenesis er veletableret, hvordan udviklingsmæssige og aktivitets afhængige processer regulerer dendritiske gren dynamik er ikke godt forstået. Dette skyldes til dels de tekniske vanskeligheder i forbindelse med levende billeddannelse og kvantitative analyser af disse fine strukturer ved hjælp af et in vivo-system. Vi etablerede en metode til at studere dendrit dynamik ved hjælp af Drosophila larve ventrale laterale neuroner (lnvs), som kan være individuelt mærket ved hjælp af genetiske tilgange og er tilgængelige for levende billeddannelse. Drage fordel af dette system, vi udviklet protokoller til at fange gren dynamik i hele dendritiske Arbor af en enkelt mærket lnv gennem time-lapse Live imaging. Derefter udførte vi post-processing for at forbedre billedkvaliteten gennem drift korrektion og dekoncentrering, efterfulgt af at analysere gren dynamik på single-Branch niveau ved at kommentere rumlige positioner af alle gren terminaler. Endelig har vi udviklet R scripts (supplerende fil) og specifikke parametre for at kvantificere gren dynamik ved hjælp af koordinat oplysninger genereret af Terminal tracing. Kollektivt, denne protokol giver os mulighed for at opnå en detaljeret kvantitativ beskrivelse af gren dynamik af neuronal dendritiske Arbor med høj tidsmæssig og rumlig opløsning. De metoder, vi udviklede, gælder generelt for tyndt mærkede neuroner i både in vitro-og in vivo-tilstande.
Dendritter er specialiserede neuronal rum, der modtager og behandler sensorisk og synaptisk input. Den komplekse og stereotype struktur af dendritiske Dorne har været under intens efterforskning siden deres opdagelse. En række modelsystemer, herunder Xenopus Optic tectal neuroner, chick retinal ganglion celler og dendritiske arborization (da) neuroner i Drosophila systemet, er blevet etableret for at studere udvikling, remodeling og plasticitet af neuronal dendritter1,2,3,4. Drosophila ventrale laterale neuroner (lnvs) er en gruppe af visuelle projektion neuroner oprindeligt identificeret for deres vigtige funktioner i døgn regulering af flyve adfærd5. Undersøgelser afslørede også larve lnvs rolle som det direkte postsynaptiske mål for larve foto (PRS)6,7. Det er vigtigt, at dyrkning af larver i forskellige lysregimer i høj grad påvirker størrelsen af LNvs ‘ dendritiske Arbors, hvilket viser, at LNvs er egnet som en ny model til undersøgelse af dendritiske plasticitet7. Det seneste arbejde fra vores gruppe viser endvidere, at både størrelsen af lnv dendrit og den dynamiske opførsel af dendritiske grene viser erfarings afhængig plasticitet8,9. Som en del af dette arbejde, udviklede vi en ny live Imaging og kvantificering protokol til at udføre analyse på dendrit dynamik af LNvs fra 2nd eller 3Rd INSTAR larver.
Den gennemsigtige natur af Drosophila larve hjernen gør den ideel til levende billeddannelse. Men de dendritiske Dorne af lnvs er beliggende i den tætbefolkede larve optisk neuropil (Lon) i midten af larve hjernen lobe6. For at fange billeder af fine dendrit grene og filopodia i intakt hjernevæv, bruger vi to-foton mikroskopi, hvilket øger dybden af lys penetration og reducerer fototoksicitet under levende billeddannelse eksperimenter10. Ved hjælp af denne opsætning, vi med succes udført Live imaging eksperimenter på LNvs for over 30 min uden at observere indlysende morfologiske forringelse af neuron. Hertil kommer, at genetiske manipulationer ved hjælp af flip-out teknik gjorde det muligt for os at mærke de enkelte lnvs med en membran Tagged gfp, som også er afgørende for overvågning af bevægelser af de enkelte grene11,12,13 .
For at fange den dynamiske opførsel af alle grene på lnv dendritiske Arbor med optimal optisk opløsning, udførte vi time-lapse 3D imaging på frisk dissekeret larve Brain bruskeksplantater med en høj rumlig opløsning på 1 min pr frame for 10 til 30 min. udvikling af lnv dendritter er meget dynamiske, med en stor procentdel af grenene viser observerbare ændringer inden for 10 min vindue. Dette fører til en af de vigtigste tekniske udfordringer i at studere dendrit dynamik, kvantificere gren adfærd baseret på 4D-billed datasæt. Tidligere etablerede metoder har forskellige begrænsninger, herunder manglende nøjagtighed og overdreven tid krav. Derfor udviklede vi en halvautomatisk metode, der kombinerer billed efterbehandling, manuel markering af afdelings terminalerne og automatisk 4D-spot sporing ved hjælp af en billed anmærknings software. Vi beregner bevægelserne af afdelings terminaler på forskellige tidspunkter baseret på 3D-koordinaterne for pletterne. Dataene eksporteres og analyseres derefter for at producere kvantitative målinger af gren dynamikken. Denne metode præcist vurderer varigheden og omfanget af udvidelse og tilbagetrækning begivenheder af eksisterende filialer, samt dannelsen af nye grene, så vi kan overvåge dendrit dynamik i et stort antal neuroner.
Her beskriver vi en protokol, vi har udviklet til at registrere og kvantificere den dynamiske opførsel af dendritiske grene i individuelt mærkede neuroner i Drosophila larve hjerner. Især vores Live imaging protokol indeholder specifikke parametre, der gør det muligt for os at fange hele dendritiske Arbor af en larve lnv og give et globalt billede af den dynamiske tilstand af dens dendrit grene. Men fordi vores kvantificeringsmetoder er stærkt afhængige af anmærkningen af afdelings terminaler, er neuroner…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde er støttet af det Intramural forsknings program af National Institute of neurologiske lidelser og slagtilfælde, National Institutes of Health. Projektnummer 1ZIANS003137.
Chameleon Vision II multiphoton laser | Coherent | ||
high vacuum grease | Dow Corning | 79751-30 | |
LSM 780 two-photon laser scanning confocal microscope | Carl Zeiss | upright configuration | |
Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-544-E | |
Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
Software | |||
Excel | Microsoft | for processing .csv files | |
Huygens Professional | Scientific Volume Imaging | for drift correction and deconvolution | |
Imaris | Oxford Instruments | for 3D visualization and image annotation | |
Reagents | |||
Glucose | |||
HEPES | |||
KCl | |||
MgCl2 | |||
NaCl | |||
NaHCO3 | |||
PBS | |||
Sucrose | |||
TES |