Dendritter er specialiserede neuronal rum, der modtager og behandler sensorisk og synaptisk input. Den komplekse og stereotype struktur af dendritiske Dorne har været under intens efterforskning siden deres opdagelse. En række modelsystemer, herunder Xenopus Optic tectal neuroner, chick retinal ganglion celler og dendritiske arborization (da) neuroner i Drosophila systemet, er blevet etableret for at studere udvikling, remodeling og plasticitet af neuronal dendritter^1,2,3,4. Drosophila ventrale laterale neuroner (lnvs) er en gruppe af visuelle projektion neuroner oprindeligt identificeret for deres vigtige funktioner i døgn regulering af flyve adfærd⁵. Undersøgelser afslørede også larve lnvs rolle som det direkte postsynaptiske mål for larve foto (PRS)^6,7. Det er vigtigt, at dyrkning af larver i forskellige lysregimer i høj grad påvirker størrelsen af LNvs ‘ dendritiske Arbors, hvilket viser, at LNvs er egnet som en ny model til undersøgelse af dendritiske plasticitet⁷. Det seneste arbejde fra vores gruppe viser endvidere, at både størrelsen af lnv dendrit og den dynamiske opførsel af dendritiske grene viser erfarings afhængig plasticitet^8,9. Som en del af dette arbejde, udviklede vi en ny live Imaging og kvantificering protokol til at udføre analyse på dendrit dynamik af LNvs fra 2^nd eller 3^Rd INSTAR larver.

Den gennemsigtige natur af Drosophila larve hjernen gør den ideel til levende billeddannelse. Men de dendritiske Dorne af lnvs er beliggende i den tætbefolkede larve optisk neuropil (Lon) i midten af larve hjernen lobe⁶. For at fange billeder af fine dendrit grene og filopodia i intakt hjernevæv, bruger vi to-foton mikroskopi, hvilket øger dybden af lys penetration og reducerer fototoksicitet under levende billeddannelse eksperimenter¹⁰. Ved hjælp af denne opsætning, vi med succes udført Live imaging eksperimenter på LNvs for over 30 min uden at observere indlysende morfologiske forringelse af neuron. Hertil kommer, at genetiske manipulationer ved hjælp af flip-out teknik gjorde det muligt for os at mærke de enkelte lnvs med en membran Tagged gfp, som også er afgørende for overvågning af bevægelser af de enkelte grene^11,12,13 .

For at fange den dynamiske opførsel af alle grene på lnv dendritiske Arbor med optimal optisk opløsning, udførte vi time-lapse 3D imaging på frisk dissekeret larve Brain bruskeksplantater med en høj rumlig opløsning på 1 min pr frame for 10 til 30 min. udvikling af lnv dendritter er meget dynamiske, med en stor procentdel af grenene viser observerbare ændringer inden for 10 min vindue. Dette fører til en af de vigtigste tekniske udfordringer i at studere dendrit dynamik, kvantificere gren adfærd baseret på 4D-billed datasæt. Tidligere etablerede metoder har forskellige begrænsninger, herunder manglende nøjagtighed og overdreven tid krav. Derfor udviklede vi en halvautomatisk metode, der kombinerer billed efterbehandling, manuel markering af afdelings terminalerne og automatisk 4D-spot sporing ved hjælp af en billed anmærknings software. Vi beregner bevægelserne af afdelings terminaler på forskellige tidspunkter baseret på 3D-koordinaterne for pletterne. Dataene eksporteres og analyseres derefter for at producere kvantitative målinger af gren dynamikken. Denne metode præcist vurderer varigheden og omfanget af udvidelse og tilbagetrækning begivenheder af eksisterende filialer, samt dannelsen af nye grene, så vi kan overvåge dendrit dynamik i et stort antal neuroner.