Time-lapse Live Imaging e quantificazione delle dinamiche del ramo dendritico veloce nello sviluppo di neuroni della Drosophila

I dendriti sono compartimenti neuronali specializzati che ricevono ed elaborano input sensoriali e sinaptici. La struttura complessa e stereotipata dei pergolato dendritici è stata oggetto di intense indagini sin dalla loro scoperta. Un certo numero di sistemi modello, tra cui i neuroni tectali ottici Xenopus, le cellule di ganglio retinica del pulcino e i neuroni dell’arborizzazione dendritica (da) nel sistema della Drosophila, sono stati istituiti per studiare lo sviluppo, il rimodellamento e la plasticità dendriti neuronali^1,2,3,4. I neuroni laterali ventrali della Drosophila (LNvs) sono un gruppo di neuroni di proiezione visiva inizialmente identificati per le loro importanti funzioni nella regolazione circadiana dei comportamenti della mosca⁵. Gli studi hanno anche rivelato il ruolo dei LNv larvali come bersaglio post-sinaptico diretto dei fotorecettori larvali (PL)^6,7. È importante sottolineare che la coltura delle larve in via di sviluppo in diversi regimi di luce influisce fortemente sulle dimensioni degli arbori dendritici di LNvs, dimostrando l’idoneità dei LNv come nuovo modello per studiare la plasticità dendritica⁷. Recenti lavori del nostro gruppo indicano inoltre che sia la dimensione del dendrite LNv che il comportamento dinamico dei rami dendritici mostrano plasticità dipendente dall’esperienza^8,9. Come parte di questo lavoro, abbiamo sviluppato un nuovo protocollo di imaging e quantificazione dal vivo per eseguire analisi sulla dinamica dendrite degli LNvs da larve instar 2^nd o 3^rd.

La natura trasparente del cervello larvale della Drosophila lo rende ideale per l’imaging dal vivo. Tuttavia, gli arbori dendritici dei LNv sono situati nel neuropil ottico larvale densamente innervato (LON) al centro del lobo cerebrale larvale⁶. Per catturare immagini di rami dendriti fini e filopodi nel tessuto cerebrale intatto, utilizziamo la microscopia a due fotoni, che aumenta la profondità di penetrazione della luce e riduce la fototossicità durante gli esperimenti di imaging dal vivo¹⁰. Utilizzando questa configurazione, abbiamo eseguito con successo esperimenti di imaging dal vivo su LNvs per oltre 30 min senza osservare l’evidente deterioramento morfologico del neurone. Inoltre, le manipolazioni genetiche utilizzando la tecnica Flip-out ci hanno permesso di etichettare i singoli LNvs con una membrana contrassegnata GFP, che è anche fondamentale per monitorare i movimenti dei singoli rami^11,12,13 .

Per catturare il comportamento dinamico di tutti i rami sul pergolato dendritico LNv con una risoluzione ottica ottimale, abbiamo eseguito immagini 3D time-lapse su espefarsi di cervello larvale appena sezionati con un’alta risoluzione spaziale a 1 min per fotogramma per 10-30 min. i dendriti sono altamente dinamici, con una grande percentuale dei rami che visualizzano cambiamenti osservabili all’interno della finestra di 10 min. Questo porta a una delle principali sfide tecniche nello studio delle dinamiche dei dendriti, quantificando il comportamento delle diramazioni in base ai set di dati delle immagini 4D. I metodi stabiliti in precedenza presentano varie limitazioni, tra cui la mancanza di precisione e l’eccessivo requisito di tempo. Pertanto, abbiamo sviluppato un metodo semi-automatico che combina la post-elaborazione dell’immagine, la marcatura manuale dei terminali di diramazione e il tracciamento automatico dei punti 4D utilizzando un software di annotazione dell’immagine. Calcoliamo i movimenti dei terminali di diramazione in diversi punti temporali in base alle coordinate 3D dei punti. I dati vengono quindi esportati e analizzati per produrre misurazioni quantitative delle dinamiche del ramo. Questo metodo valuta accuratamente la durata e l’estensione degli eventi di estensione e ritrazione dei rami esistenti, nonché la formazione di nuovi rami, consentendoci di monitorare le dinamiche dei dendriti in un gran numero di neuroni.