JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
免疫与感染

siRNA Electroporation voor het moduleren van Autophagie in herpes simplex virus type 1-geïnfecteerde monocyt-afgeleide dendritische cellen

Published: October 28, 2019
doi:
10.3791/60190
, , , , , ,
1Department of Immune Modulation,Universitätsklinikum Erlangen

Summary

In deze studie presenteren we remmers-en siRNA-gebaseerde strategieën om te interfereren met autophagische flux in herpes simplexvirus type-1 (HSV-1)-geïnfecteerde monocyte-afgeleide dendritische cellen.

Abstract

Herpes simplexvirus type-1 (HSV-1) induceert autophagie in beide, onvolgroeide dendritische cellen (Idc’s) en volwassen dendritische cellen (Mdc’s), terwijl autophagische flux alleen in Idc’s wordt waargenomen. Om mechanistische inzichten te verwerven, ontwikkelden we efficiënte strategieën om de HSV-1-geïnduceerde autophagische omzet te verstoren. Een op remmers gebaseerde strategie, om HSV-1-geïnduceerde autophagie te moduleren, vormt de eerste keuze, omdat het een eenvoudige en snelle methode is. Om mogelijke onspecifieke off-target effecten van dergelijke verbindingen te omzeilen, ontwikkelden we een alternatieve siRNA-gebaseerde strategie, om autophagische omzet in Idc’s te moduleren op HSV-1-infectie. Inderdaad, elektroporation van Idc’s met FIP200-specifieke siRNA voorafgaand aan HSV-1-infectie is een zeer specifieke en succesvolle methode om FIP200 eiwit expressie te ablaat en daardoor de autophagische flux te remmen. Beide gepresenteerde methoden resulteren in een efficiënte remming van HSV-1-geïnduceerde autophagische omzet in Idc’s, waarbij de siRNA-gebaseerde techniek meer doelgericht is. Een aanvullende siRNA-gebaseerde aanpak werd ontwikkeld om selectief de eiwit expressie van KIF1B en KIF2A te dempen, waardoor autophagische omzet op HSV-1-infectie in Mdc’s werd vergemakkelijkt. Concluderend, de techniek van siRNA electroporatie vertegenwoordigt een veelbelovende strategie, om selectief de uitdrukking van verschillende eiwitten te ablaten en om hun invloed op een HSV-1-infectie te analyseren.

Introduction

De generatie van humane monocyte-afgeleide dendritische cellen (DCs) vormt een geschikt in vitro model om de functies en biologie van dit belangrijke immuunceltype te bestuderen. Isolatie en differentiatie van monocyten in dc’s is in de afgelopen jaren1,2. De infectie van DCS met het α-herpesvirus herpes simplexvirus type-1 (HSV-1) dient als een modelsysteem om HSV-1-gemedieerde modulaties van DC-biologie te bestuderen2,3,4,5,6 . Dit is vooral belangrijk om te verhelderden hoe herpesvirussen dempen of remmen van krachtige antivirale immuunresponsen, latentie in immuun-bevoorrechte niches in de gastheer7,8vast te stellen. In dit verband zijn herpesvirussen zeer succesvolle pathogenen die breed verspreid zijn over de hele bevolking en een seroprevalentie bereiken van maximaal 90% volgens de geografische regio9. Om dit te begrijpen en eventueel te voorkomen, zijn meer inzichten in de HSV-1-gemedieerde modulaties van het immuunsysteem van de gastheer, en in het bijzonder van immuuncellen zoals DCs, vereist.

Een volledig nieuwe waarneming met betrekking tot het samenspel van DCs met HSV-1 werd onlangs gepubliceerd door Turan et al.10. De auteurs hebben aangetoond dat de voltooiing van de HSV-1-replicatie strikt afhankelijk is van de rijpings status van DCs. In Idc’s wordt volledige replicatie van HSV-1 vergemakkelijkt door autophagy-afhankelijke mechanismen. Terwijl HSV1 autophagy induceert in zowel iDCs als Mdc’s, wordt autophagic flux alleen in Idc’s waargenomen. Dit vergemakkelijkt op zijn beurt de nucleaire uitgaande van virale capsid’s via autophagische afbraak van nucleaire laminen in idc’s. Om mechanistische inzichten te verwerven in deze HSV-1-geïnduceerde afbraak route in Idc’s versus Mdc’s, zijn nieuwe en efficiënte strategieën van cruciaal belang om autophagische flux te onderzoeken.

Macroautophagy (autophagy) is een goed gecondengeerde meerstaps proces gericht op intracellulaire eiwitten of hele organellen voor lysosomale spijsvertering11. Simplistisch kan autophagie worden onderverdeeld in de (i) initiatie, (II) membraan nucleatie, (III) blaasje expansie, en (IV) autophagosome-lysosome fusie fase12. Tijdens de initiatie (i) zijn componenten zoals het geactiveerde ULK1/2 kinase complex, dat de focale adhesie kinase familie in interactie heeft met eiwitten van 200 kD (FIP200), van cruciaal belang om het beclin-1-Vps34-AMBRA1 complex te activeren. Vervolgens, membraan nucleatie (II) initieert phagophore formatie13, die overspoelt cytoplasmatische ladingen die worden gekenmerkt door moleculen zoals P6214. Tijdens de blaasje expansie en autophagofoerts rijping (III) microtubulus-geassocieerde eiwit lichtketting 3 (LC3)-I wordt omgezet in de lipide vorm LC3-II die in het autophagosomale membraan wordt ingebracht. Dus, LC3-I naar-II conversiepercentages zijn een indicator voor autophagy inductie door het spiegelen van de vorming van volwassen autophagosomes15,16. Bij autophagosome-lysosome Fusion (IV) ondergaan niet alleen de autophagische lading, maar ook geassocieerde P62 en LC3-II eiwitten afbraak (bijv. door hydrolyse). Dus, verlies van P62 en LC3-II dienen als markers voor autophagic flux17. De fusie van autophagosomes met lysosomes, en dus na de autophagische omzet, is sterk afhankelijk van de intracellulaire lysosomale lokalisatie. Dit is onder andere gereguleerd door de kinesin familieleden KIF1B en KIF2A, die werden aangetoond dat het negatief beïnvloeden autophagosome-lysosome Fusion18. Interessant is dat eiwit expressie van KIF1B en KIF2A wordt geïnduceerd op gelijkstroom rijping en is daardoor verantwoordelijk voor de inefficiënte autophagic flux in HSV-1-geïnfecteerde Mdc’s, wat de complete HSV-1 Replication10belemmert.

Experimentele pogingen om autophagy moduleren omvatten het gebruik van stoffen bekend voor het opwekken of remmen van deze specifieke route19,20,21. In deze studie beschrijven we twee op remmers gebaseerde strategieën om autophagische omzet in HSV-1-geïnfecteerde Idc’s te blokkeren. De eerste compound gebruikt in onze experimenten is specifieke en potente autophagy inhibitor-1 (spautin-1), die werd beschreven ter bevordering van beclin-1-Vps34-AMBRA1 complexe afbraak tijdens de initiatie fase van autophagy22. De tweede verbinding die in de huidige studie wordtgebruikt, is bafilomycine-a1 (BA1), een V-ATPase-remmer die de late autophagische gebeurtenissen blokkeert (d.w.z. autophagosome-lysosome Fusion en autolysosome verzuring)23,24. Het gebruik van een van deze twee remmers voorafgaand aan iDC-infectie met HSV-1 remt de autophagie krachtig, maar verstoort de efficiënte virale genexpressie niet. Zo biedt deze op remmers gebaseerde strategie voorafgaand aan de HSV-1-infectie een krachtig hulpmiddel om HSV-1-geïnduceerde autophagische flux te remmen die gemakkelijk kan worden uitgebreid voor een overvloed aan verschillende celtypen en virussen, die ook autophagie mogelijk induceren.

Om een belangrijk nadeel van een op remmers gebaseerde aanpak te overwinnen(d.w.z. niet-specifieke off-target effecten), ontwikkelden we een op siRNA gebaseerde methode om autophagische flux in (HSV-1-geïnfecteerde) idc’s te blokkeren. De techniek van siRNA electroporatie is een krachtige alternatieve strategie, via selectieve ablatie van de expressie van verschillende eiwitten (d.w.z. autophagische componenten). In onze experimenten werden Idc’s elektroporated met FIP200-specifieke siRNA met behulp van het elektroporation apparaat I (Zie tabel van de materialen) en een gewijzigd protocol beschreven door Gerer et al. (2017) en Prechtel et al. (2007), voor de remming van autophagy tijdens de initiatie fase25,26. Deze techniek stelde ons in de mogelijkheid om specifiek FIP200 expressie in Idc’s op te nemen, zonder de levensvatbaarheid van de cellen en hun onvolgroeide fenotype twee dagen na elektroporation te verstoren. Opmerkelijk, HSV-1 infectie werd vastgesteld in deze elektroporated Idc’s gespiegeld door efficiënte virale eiwit expressie. Deze op siRNA gebaseerde techniek biedt een uniek voordeel (d.w.z. dat een verscheidenheid aan autophagische componenten, zelfs in combinatie), specifiek gericht kan zijn op de ablatie van hun expressie.

In deze studie beschrijven we verder een siRNA-gebaseerde methode om autophagische flux te induceren, ook in HSV-1-geïnfecteerde Mdc’s. In dit geval werden Idc’s elektroporated met siRNA gericht tegen KIF1B en KIF2A voorafgaand aan de rijping van de gelijkstroom met behulp van het elektroporation-apparaat II (Zie tabel met materialen). Aangezien beide eiwitten upregulated zijn tijdens de rijping van de gelijkstroom en bekend is dat de fusie van autophagosomes met lysosomen10,18negatief wordt gereguleerd, hebben hun knockdown de autophagische flux in mdc’s sterk geïnduceerd op HSV-1-infectie. Zo stelde de op siRNA gebaseerde techniek ons in staat om specifiek autophagische omzet te induceren via inmenging in de KIF-eiwit expressie in Mdc’s, en daardoor hun uitdrukkings niveaus in Idc’s te imiteren.

Samengevat, presenteren we twee verschillende methoden voor de remming van autophagic flux in HSV-1-geïnfecteerde Idc’s. Hoewel de eerste op remmers gebaseerde aanpak een gemakkelijke, goedkope en snelle manier vormt om de auto-degradatie te verstoren, is de tweede op siRNA gebaseerde techniek specifieker en een zeer geschikte methode om de resultaten van op remmers gebaseerde Experimenten. Daarnaast beschrijven we een methode voor het opwekken van autopragische flux ook in HSV-1-geïnfecteerde Mdc’s, via de siRNA-gemedieerde knockdown van twee KIF-eiwitten.

Protocol

Op monocyte afgeleide Dc’s werden opgewekt uit leukaferese producten van gezonde donoren. Hiervoor is een positieve stem van de lokale ethische commissie verkregen (referentienummer 4556). De experimenten van de huidige studie werden uitgevoerd in overeenstemming met de aanbevelingen van de ethische commissie van de “Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg” (referentienummer 4556). Alle donoren hebben een schriftelijke geïnformeerde toestemming goedgekeurd, inclusief de verklaring van Helsinki. 1. opwekking en behandeling van onrijpe dendritische cellen (Idc’s) en volwassen dendritische cellen (Mdc’s) Isoleer humane perifere bloed mononucleaire cellen (Pbmc’s) van leukoreduction System Chambers (LRSCs) zoals eerder beschreven27. Vermijd cryopreservering van PBMCs en gebruik ze direct na isolatie om hogere gelijkstroom opbrengsten te verkrijgen. Genereer menselijke dc’s van PBMCs van verschillende gezonde donoren in T175 celkweek kolven zoals eerder beschreven10,27. Gebruik in het kort 350-400 miljoenen PBMCs in 30 mL DC medium (RPMI 1640 zonder L-glutamine, 1% (v/v) AB-serum, 100 U/mL penicilline, 100 mg/mL streptomycine, 0,4 mM L-glutamine, 10 mM HEPES) per celkweek kolf voor isolatie van monocyten door hechting. Spoel na 1 uur de niet-aanhangbare breuk af met behulp van de RPMI 1640. Voeg vers DC-medium toe, aangevuld met 800 U/mL GM-CSF en 250 U/mL IL-4, en incuberen gedurende 3 dagen. Voeg op dag 3 na hechting 5 mL vers DC-medium met GM-CSF en IL-4 toe met een eindconcentratie van respectievelijk 400 U/mL en 250 U/mL per celkweek kolf voor DC-differentiatie. Om Idc’s te oogsten, moet u op dag 4 na de hechting zachtjes losaanhechting Idc’s uit de bodem van de celkweek kolf spoelen. Herhaal deze stap 2 keer. Voor het genereren van Mdc’s, voeg rijping cocktail samengesteld als volgt: GM-CSF (eindconcentratie: 40 U/mL), IL-4 (eindconcentratie: 250 U/mL), Il-6 (eindconcentratie: 1000 U/mL), IL-1β (eindconcentratie: 200 U/mL), TNF-α (eindconcentratie: 10 ng/ mL), prostaglandine E2 (PGE2; eindconcentratie: 1 μg/mL). Zes dagen na de hechting (twee dagen na inductie van rijping met behulp van een cytokine-cocktail), spoelen Mdc’s af vanaf de bodem van de celkweek kolf. Herhaal deze stap twee keer.Opmerking: onrijpe en volwassen Dc’s kunnen opeenvolgend worden gegenereerd door identieke donoren in 1 celkweek kolf. Om dit te doen, (i) het juiste aantal Idc’s te scheiden en (II) de rijping van de overblijvende cellen in de kolven te induceren met behulp van de in stap 1.2.2 vermelde cytokine-cocktail. Overdracht van Idc’s of Mdc’s in het respectieve celcultuurmedium in buizen van 50 mL. Oogst de cellen via centrifugeren bij 300 x g gedurende 5 minuten. Langzaam respenderen (= wassen) DCs in 5-10 mL RPMI 1640 per celkweek kolf. Combineer de respectievelijke DC suspensies in één buis. Definieer het celnummer met behulp van een telkamer of een alternatieve methode. Vermijd temperatuurveranderingen bij het hanteren van Idc’s, om het risico op fenotypische veranderingen te verminderen. 2. Flow cytometrische analyses om de fenotypische rijpings status te bewaken Transfer Idc’s of Mdc’s (0,5 x 106) van stap 1.3.1 naar een buis van 1,5 ml. Oogst de cellen via centrifugeren bij 3390 x g gedurende 1,5 min. was de cellen eenmaal met een FACS buffer (PBS aangevuld met 2% foetaal kalf serum (FCS)). Rebreng de cellen in 100 μL antilichaam kleurstofoplossing (FACS buffer) met specifieke fluor Chrome-gelabelde antilichamen tegen gedefinieerde oppervlakte moleculen. Gebruik de volgende antilichamen om de zuiverheid te controleren (CD3-FITC, CD14-PE) evenals de rijpings status van DCs (CD80-PacBlue/-PE-Cy5, CD11c-PE-Cy5, CCR7-PE-Cy7, CD83-APC, CD86-PE, MHCII-APC-Cy7). Maak een onbevlekt monster in 100 μL FACS buffer als een controle. Vlek de cellen gedurende 30 minuten op ijs in het donker. Spoel vervolgens de cellen twee keer in 1 mL FACS buffer en centrifugeer bij 3390 x g gedurende 1,5 min. Ten slotte, respendeer de cellen in 200 μL FACS buffer aangevuld met 2% PFA en analyseer de cellen door Flowcytometrie. Vaste cellen kunnen worden bewaard bij 4 ° C in het donker tot 2 dagen. 3. infectie procedure van DCs met herpes simplexvirus type-1 (HSV-1) en interferentie van HSV-1-geïnduceerde autophagic flux via spautin-1 of bafilomycine-a1 Opmerking: de stam HSV-1/17 +/CMV-EGFP/UL43 (HSV-1 EGFP) gebruikt in deze studie werd verkregen uit de laboratorium stam HSV-1 stam 17 +. De HSV-1 EGFP-stam drukt het verbeterde groene fluorescerende eiwit (EGFP) uit dat is ingebracht in de UL43 Gene Locus onder controle van de promotor CMV. EGFP dient als marker voor HSV-1-infectie. Bovendien werd de stam HSV1-RFPVP26 gebruikt voor DC-infectie studies (eerder beschreven in Turan et al., 2019). Dit virus drukt de capside oppervlak eiwit VP26 gesmolten tot monomeer rood fluorescerende eiwit (mRFP). Transfer Idc’s of Mdc’s (2 x 106) van stap 1,3 in een 2 ml buis. Centrifugeer vervolgens de cellen op 3390 x g gedurende 1,5 min en gooi het supernatant weg. De cellen in een infectie medium voorzichtig hervatten (RPMI 1640 aangevuld met 20 mM HEPES). Voor de remming van de autophagosomale-lysosomale afbraak route, pre-behandelen DCs met spautin-1 of bafilomycine-a1 1 h voorafgaand aan infectie. Voeg 10 μM spautin-1 of 1 μM BA1, of DMSO als onbehandelde controle, toe aan het infectie medium. Inincuberen de cellen in een verwarmingsblok bij 300 rpm schudden bij 37 °C gedurende 1 uur. Voor infectie studies, inoculeren van de cellen met HSV-1 virionen bij een veelheid van infectie (MOI) van 2. Voeg het respectieve volume MNT buffer (30 mM 2-(N-morpholino) ethanesulfoninezuur (MES), 100 mM NaCl, 20 mM tris) als mock Control toe. Inincuberen de cellen in een verwarmingsblok bij 300 rpm schudden bij 37 °C gedurende 1 uur. 1 h post infectie (HPI), verzamel de cellen op 3390 x g voor 1,5 min. aspirate entmateriaal en voorzichtig respenderen de cellen in DC medium met 40 U/ml GM-CSF, 250 U/ml Il-4 en ofwel 10 μM spautin-1 μm BA1, of DMSO als controle. Zaad met een mock behandelde en HSV-1 geïnfecteerde cellen in een uiteindelijke concentratie van 1 x 106/ml in een 6-well plaat. Bij 16-24 HPI, oogst de cellen doorspoelen (Mdc’s) of met behulp van een celscraper (Idc’s). Breng de cellen over in een 1,5 mL safelock-buis. Verzamel de cellen via centrifugeren bij 3390 x g voor 1,5 min en was de pellet één keer door 1 ml PBS toe te voegen. De cellen in lysismix met 29 μL 2x Roti-load, 1 μL 100 mM MgCl2 en 12,5 U/ml benzonase, worden krachtig hervat. Voor cellyse en DNA-spijsvertering met benzonase, incuberen de monsters bij 37 °C gedurende 10 minuten. Vervolgens, denatureren de eiwitten bij 95 °C gedurende 10 min. Voer SDS-PAGE en Western Blot analyses uit om de eiwit niveaus van LC3BI/II, P62, ICP0/5 en GAPDH te controleren. 4. interferentie van de HSV-1-geïnduceerde autophagic flux via elektroporation van Idc’s met behulp van FIP200-siRNA Opmerking: het huidige protocol voor siRNA electroporatie is gewijzigd van prechtel et al. (2007) en Gerer et al. (2017). Transfer Idc’s (12 x 106) op dag 3,5 post hechting in een buis van 50 ml. Centrifugeer vervolgens de cellen op 300 x g gedurende 5 minuten en gooi het supernatant weg. Parallel, voer flow flowcytometrische analyse om de rijpings status te bewaken zoals beschreven in stap 2 (gebruik Life/Dead Violet in plaats van CD80-PacBlue). Spoel Idc’s voorzichtig in 5 mL OptiMEM zonder fenolrood en centrifugeer de cellen bij 300 x g gedurende 5 minuten. Gooi het supernatant weg en breng idc’s voorzichtig in 200 ΜL optimem zonder fenolrood aan, waarbij een celconcentratie van 6 x 106/100 μL wordt aangepast. Plaats de cellen niet op ijs en Vermijd temperatuurveranderingen. Beweeg snel en vermijd lange incubatie perioden van Idc’s in OptiMEM zonder fenolrood. Breng ofwel 75 pmol van FIP200-specifieke siRNA of 75 pmol van roersirna, als controle, over in 4 mm elektro cuvettes en voeg 100 μL (6×106 cellen) van de celsuspensie toe. Direct puls-Idc’s met behulp van het elektroporation-apparaat I, waarbij de volgende instellingen worden toegepast: 500 V voor 1 MS. Voorafgaand aan de experimentele procedure, bereiden siRNA suspensies volgens de instructies van de fabrikant, aliquot en bewaar ze bij-20 °C. Ontdooien en op het ijs houden bij gebruik van deze siRNAs voor elektroporation. Voordat u de monsters gaat elektrolyt, moet u een test puls uitvoeren. Na elektroporation, direct overbrengen van iDC in 6-well platen met verse pre-warmed DC medium (aangevuld met 40 U/mL GM-CSF en 250 U/mL IL-4). Zaai de cellen in een uiteindelijke concentratie van 1 x 106/ml en plaats ze in een incubator. Spoel de cellen niet uit de electro kuvette. Na 48 h, eerst onderzoeken de morfologie van elektroporated iDCs microscopisch. Oogst vervolgens de cellen met behulp van een celscrapper en breng ze over in 15 mL tubes. Spoel de putjes af met 1 mL PBS aangevuld met 0,01% EDTA en breng de oplossing over in de respectieve buisjes. Splits vervolgens 6 x 106 idc’s per siRNA-voorwaarde zoals beschreven in de volgende stappen. Gebruik 0,5 x 106 cellen om de rijpings status en de levensvatbaarheid van de cel te beoordelen, zoals beschreven in stap 2. Gebruik de volgende antilichamen: CD11c-PE-Cy5, CCR7-PE-Cy7, CD83-APC, MHCII-APC-Cy7 en Life/Dead Violet. Gebruik 1 x 106 -cellen voor Western Blot-analyses om FIP200-specifieke knockdown-efficiëntie te controleren. Breng de cellen over in een 1,5 mL safelock-buis door centrifugeren bij 3390 x g gedurende 1,5 min. bereid de cellysaten voor zoals beschreven in stap 3,4 en voer westerse Blot-analyses uit. Gebruik de resterende cellen (4,5 x 106) voor HSV-1-infectie experimenten. Voor elke experimentele aandoening, overdracht 2,25 x 106 idc’s in 2 ml buizen en ofwel infecteren ze met HSV1 bij een MOI van 2 of Voeg mnt buffer als een mock Control. Voer de infectie uit zoals beschreven in stap 3,3. Bij 20 HPI, oogst de cellen met behulp van een celscraper en bereid cellysaten voor Western Blot analyses zoals beschreven in stap 3,4. 5. modulatie van de autophagosome-lysosomale route in HSV-1-geïnfecteerde mdc’s met behulp van KIF1B/2a-siRNA electroporatie Transfer Idc’s (24 x 106) op dag 4 na hechting in een tube van 50 ml. Centrifugeer vervolgens de cellen op 300 x g gedurende 5 minuten en gooi het supernatant weg. Voorzichtig respenderen (= wassen) Idc’s in 8 mL PBS, om een uiteindelijke celconcentratie van 3 x 106/mlaan te passen. Breng 3 x 106 cellen over in 1,5 ml tubes en oogst de cellen bij 3390 x g gedurende 1,5 min. Respendeer Idc’s in 100 μL buffer P3 met de supplement-mix (volgens de instructies van de fabrikant; apparaat voor elektroporation Kit II) en hetzij (i) 75 pmol van KIF1B-specifieke siRNA, (II) 75 pmol van KIF2A-specifieke siRNA, of (III) beide. Gebruik (IV) de respectieve hoeveelheid gecodeerde siRNA als een controle. Bereid twee buizen voor elke siRNA-aandoening (6 x 106 -cellen) en breng de suspensies over in afzonderlijke elektro cuvettes. Direct Pulse Idc’s die de puls “EH-100” toepassen met behulp van het elektroporation-apparaat II. Voorafgaand aan de experimentele procedure, bereiden siRNA suspensies volgens de instructies van de fabrikant, aliquot en bewaar ze bij-20 °C. Ontdooien en op het ijs houden bij gebruik van deze siRNAs voor elektroporation. Plaats geen Idc’s op ijs en Vermijd temperatuurveranderingen. Beweeg snel en Vermijd een lange incubatie van Idc’s in PBS of buffer P3. Voeg direct na de elektroporation 500 μL voorverwarmde RPMI 1640 toe aan Electro cuvettes. Incuberen de cellen in een incubator voor 5-10 min. Transfer Idc’s in 6-well platen met vers voorverwarmde DC medium (aangevuld met 40 U/mL GM-CSF en 250 U/mL IL-4). Combineer de respectieve condities in één put, zaai de cellen in een uiteindelijke concentratie van 1 · 106/ml en plaats ze in een incubator. 4 h na incubatie, voeg de rijpings cocktail toe met de cytokinen vermeld in stap 1.2.2.Opmerking: bereid één monster van niet-electroporated DCs (1 x 106) als controle voor flow flowcytometrische analysen 2 dagen na elektroporation. Behandel de controle cellen op analoge wijze tot elektroporated samples. Twee dagen na elektroporation, oogst cellen door resuspensie en overdracht in 15 mL buizen. Spoel de putjes af met 1 mL PBS en breng de suspensies in de respectieve buisjes over. Split 6 · 106 dc’s per siRNA-voorwaarde zoals beschreven in de volgende stappen: Gebruik 0,25 x 106 DCS (elektroporated en niet-elektroporated) om te controleren op rijpings status en de levensvatbaarheid van de cellen, zoals beschreven in stap 2. Gebruik de volgende antilichamen: CD80-PE-Cy5, CD83-APC, CD86-PE, MHCII-APC-Cy7, en Life/Dead Violet. Gebruik 0,75 x 106 cellen voor Western Blot-analyses om de KIF1B/2a-specifieke knockdown-efficiëntie te beoordelen. Verzamel de cellen in een 1,5 mL safelock-buis door centrifugatie bij 3390 x g gedurende 1,5 min. bereid cellysaten voor zoals beschreven in stap 3,4 en voer westerse Blot-analyses uit. Gebruik de resterende cellen (5 x 106) van elke siRNA-aandoening en voer HSV-1-infectie experimenten uit. Breng voor elke experimentele aandoening 2,5 x 106 idc’s over in 2 ml buizen en besmetten ze met HSV-1 bij een MOI van 2 of Voeg mnt buffer toe als een mock Control. Voer de infectie uit zoals beschreven in stap 3,3. Bij 20 h post infectie, oogst de cellen door resuspensie en bereidt celllysates voor Western Blot-analyses voor om de inductie van HSV-1-geïnduceerde autophagic-omzet te controleren, zoals hierboven beschreven in stap 3,4.

Representative Results

In dit manuscript beschrijven we methoden om te interfereren met HSV-1-geïnduceerde autophagy in dendritische cellen. Dit omvat de opwekking van humane monoyte-afgeleide Idc’s en Mdc’s, die fenotypisch werden geanalyseerd door Flowcytometrie (Figuur 1). Op dag 4 na de hechting vertonen DCs een onvolwassen fenotype dat wordt gekenmerkt door een zwakke expressie van CD80, CCR7 en CD83, evenals een hoge CD11c-en intermediaire MHCII-expressie. Aangezien CD3-en CD14-signalen ontbreken, kunnen de contaminaties van T-cellen en monocyt worden uitgesloten. Op dag 6 na de hechting (d.w.z. dag 2 na inductie van rijping) vertonen DCs een volwassen fenotype dat wordt weerspiegeld door een significante toename van de oppervlakte expressie CD80, CCR7, CD83 en MHC-II. Infectie met een eGFP-expressie van HSV-1-stam (Figuur 2) resulteert in een bijna volledige infectie van idc’s(figuur 2a bovenste paneel) of mdc’s (Figuur 2a onderste paneel, Figuur 2B), gebaseerd op sterke GFP-signalen geanalyseerd door fluorescentiemicroscopie en Flowcytometrie. Zoals blijkt uit ons recente rapport, induceert HSV-1 autophagy zowel in Idc’s als in Mdc’s, maar de omzet van autophagic vindt in Idc’s slechts10plaats. In een eerste benadering behandelden we Idc’s en Mdc’s met spautin-1 (Figuur 3a)-om autophagie initiatie te blokkeren-of bafilomycine-a1 (BA1; Figuur 3B)-voor de remming van de laatste autophagosome-lysosome Fusion. Bij HSV-1-infectie van Idc’s in afwezigheid van spautin-1 en BA1 wordt autophagic flux gespiegeld door respectievelijk de achteruitgang van de P62-en LC3B-expressie. HSV-1-infectie van Mdc’s in de afwezigheid van spautin-1 heeft daarentegen geen invloed op P62 expressie, terwijl spautin-1 en BA1-behandeling een accumulatie van LC3B-II induceren. Dit weerspiegelt de inductie van autophagie, maar een mislukking van autophagische omzet in Mdc’s. In Idc’s herstelt spautin-1 voor behandeling de autophagische afbraak van P62 op de HSV-1-infectie sterk vanwege de remming van de autophagie tijdens de beginfase. Bij voor behandeling met BA1 vertonen mock-en HSV-1-geïnfecteerde Idc’s een sterke accumulatie van LC3B-II eiwit niveaus, wat duidt op een geslaagde remming van de autophagische omzet via het blokkeren van late autophagosome-lysosome Fusion. In overeenstemming hiermee resulteert spautin-1 en BA1 voor behandeling van Mdc’s ook in stabiele P62 en verhoogde LC3B-II eiwit niveaus, respectievelijk. In een tweede methode om de autophagic flux te beschadigen, wordt siRNA electroporatie gericht op FIP200 onderzocht met betrekking tot de capaciteit om autophagische flux te blokkeren bij idc’s die met HSV-1 zijn geïnfecteerd. Zoals getoond in Figuur 4A, werden sterk verlaagde FIP200 eiwit niveaus gedetecteerd in IDCS 48 h post elektroporation, vergeleken met Control siRNA. Op dit moment vertonen Idc’s geen tekenen van celdood (Figuur 4B) en behouden ze hun onrijpe fenotype (Figuur 4C). Infectie van de FIP200-Idc’s met HSV-1 onthult een sterke afname van de autophagische flux in vergelijking met de met hun controle siRNA behandelde tegenhangers (Figuur 4D). Dit gaat gepaard met verhoogde eiwit niveaus van LC3B en P62 wanneer FIP200 wordt onderdrukt in HSV-1-geïnfecteerde Idc’s. In een omgekeerde poging bestudeerden we of siRNA-gemedieerde ablatie van KIF1B en KIF2A eiwit expressie autophagosomale-lysosomale omzet ook in HSV-1-geïnfecteerde Mdc’s mogelijk maakt. Zo werden Idc’s elektroporated met behulp van specifieke Sirna’s gericht op één of beide eiwitten, en werden de cellen vervolgens gerijpt (Figuur 5). 2 dagen na elektroporation vertonen Mdc’s een sterke reductie van KIF1B en/of KIF2A eiwit expressie, wanneer specifieke Sirna’s werden gebruikt (Figuur 5a). Deze methode leidde ook niet tot een prominente celdood (Figuur 5B), noch tot veranderingen in hun fenotypische Rijpings status (Figuur 5C). Ter ondersteuning van het belang van KIF1B en KIF2A tijdens autophagosomal-lysosomale afbraak, vergemakkelijkt hun depletie voorafgaand aan de HSV-1-infectie een verhoogde autophagische flux in Mdc’s. Dit wordt weerspiegeld door een verlaagd residu P62 eiwitgehalte, in tegenstelling tot de respectieve controle voorwaarde (Figuur 5D). Figuur 1: fenotypische karakterisering van door de mens monocyte afgeleide idc’s en mdc’s met behulp van Flowcytometrie. DCs werden gegenereerd en gekleurd met specifieke antilichamen om hun zuiverheid te controleren: (a) CD3 om T-celcontaminaties uit te sluiten, (B) CD14 om besmetting met monocyten uit te sluiten, en (C) CD11c als een marker voor DCS. Om hun fenotypische rijpings status te beoordelen, werden de volgende antilichamen gebruikt: (D) CD80, (E) CCR7, (F) CD83, en (G) mhcii. Deze moleculen worden sterk uitgedrukt op Mdc’s en laten zo de discriminatie tussen het onvolgroeide en volwassen gelijkstroom fenotype toe. Gegevens werden geanalyseerd met behulp van FCS Express 5,0. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Figuur 2: microscopische en flowcytometrische analyses van HSV-1-geïnfecteerde idc’s en mdc’s. Idc’s en Mdc’s waren geïnfecteerd met een HSV-1-stam die EGFP (HSV-1 EGFP) uitsprak, om het besmettings percentage op basis van het GFP-signaal te kwantificeren. A) microscopische analyses van GFP-positieve HSV-1-geïnfecteerde idc’s en mdc’s die zijn geïnfecteerd met een MOI van 2, vergeleken met hun niet-geïnfecteerde tegenhangers, bij 24 HPI. Om geïnfecteerde cellen te visualiseren, werd GFP fluorescentie gecontroleerd. Schaalbalk vertegenwoordigt 400 μm. (B) flowcytometrische meting van mock-of HSV-1-geïnfecteerde mdc’s tijdens infectie kinetiek. Bovenste panelen (zwart bekleed histogrammen) Toon mock voorwaarde, onderste panelen (zwarte gevulde histogrammen) tonen HSV-1-geïnfecteerde cellen na de aangegeven tijdpunten post infectie. Gegevens werden geanalyseerd met behulp van FCS Express 5,0. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Figuur 3: Spautin-1 en b afilomycine-a1 moduleren de autophagic flux in HSV-1-geïnfecteerde Idc’s. Idc’s en Mdc’s werden behandeld met (A) spautin-1 of (B) Bafilomycine-a1 (BA1) voor 1 uur voorafgaand aan de infectie. Cellen werden vervolgens mock-of HSV-1-geïnfecteerde (HSV1-RFPVP26) met behulp van een MOI van 2. Na 16-18 h werden Dc’s geoogst en werden eiwithoudende lysaten onderworpen aan westerse blotting om de expressie van P62 of LC3B-I/-II als autophagische markers te bepalen, ICP0 als infectiebeheersing en GAPDH als ladings controle. LC3B-I en LC3B-II eiwit niveaus werden gekwantificeerd en genormaliseerd naar de referentie proteïne GAPDH met behulp van Bio1D (optische dichtheid). De verhouding van genormaliseerde LC3B-II naar genormaliseerde LC3B-I-signalen wordt weergegeven. Dit cijfer is aangepast en aangepast van © 2019 Turan et al. oorspronkelijk gepubliceerd in JCB. https://doi.org/10.1083/jcb.20180115110. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Figuur 4: analyse van autophagische flux in HSV-1-geïnfecteerde Idc’s op FIP200-siRNA-elektroporation. Idc’s werden met behulp van het elektroporation-apparaat met de controle siRNA of FIP200-specifieke siRNA geanalyseerd I.a) dc’s werden onderzocht met betrekking tot de efficiëntie van FIP200 knockdown 48 h post-elektroporation, door Western Blot-analyses uit te voeren. B) de levensvatbaarheid van de cellen en de (C) rijpings status werden geanalyseerd voorafgaand aan elektro poration (licht blauwe histogrammen) en 48 h post (donker blauwe en grijze histogrammen) elektroporation door Flowcytometrie. Mediaanwaarden voor drie verschillende donoren worden weergegeven. Na het bevestigen van de efficiënte knockdown van FIP200 en de onrijpe fenotype, cellen waren HSV-1-geïnfecteerde (HSV-1 EGFP) met behulp van een MOI van 2. Gegevens werden geanalyseerd met behulp van FCS Express 5,0. D) na een infectie van 20 uur werden de cellen onderworpen aan westerse Blot-analyses om de uitdrukking van LC3B-I/-II en P62 als autophagische markers te bepalen. ICP5 werd gedetecteerd als infectie controle, en GAPDH als ladings controle. De panelen A en D zijn gewijzigd en aangepast van © 2019 Turan et al. oorspronkelijk gepubliceerd in JCB. https://doi.org/10.1083/jcb.20180115110. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Figuur 5: siRNA-gemedieerde ablatie van KIF1B en/of KIF2A moduleert autophagische omzet in HSV-1-geïnfecteerde Mdc’s. Idc’s werden elektroporated met KIF1B-specifieke en/of KIF2A-specifieke siRNA, evenals Control siRNA, met behulp van het elektroporation-apparaat II. Bij 4 h post elektroporation, rijping werd geïnduceerd door toevoeging van een rijping cocktail. Bij 48 h post elektroporation werden DCs geanalyseerd met betrekking tot (a) de efficiëntie van Kif-knockdown via Western blotting, (B) de levensvatbaarheid van de cellen en hun (C) fenotypische rijpings status met behulp van flowcytometrische analyses (twee verschillende donoren worden getoond). “w/o EP” betekent zonder elektroporation, maar na inductie van rijping; “post Control EP” betekent post-elektroporation met behulp van Control siRNA; “post KIF1B, KIF2A, KIF1B/2A EP” betekent post-elektroporation met behulp van KIF1B-en/of KIF2A-specifieke siRNA. Na het bevestigen van de efficiënte knockdown van KIF1B en/of KIF2A en de volwassen fenotype, cellen waren HSV-1-geïnfecteerde (HSV-1 EGFP) met behulp van een MOI van 2. Gegevens werden geanalyseerd met behulp van FCS Express 5,0. D) de cellen werden onderworpen aan een analyse van 20 uur na de besmetting met Western Blot, teneinde de uitdrukking van P62 als autophagische marker te beoordelen. ICP5 werd gebruikt als een infectie controle, en GAPDH als laden controle. Figuren A en D zijn gewijzigd en aangepast van © 2019 Turan et al. oorspronkelijk gepubliceerd in JCB. https://doi.org/10.1083/jcb.20180115110. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Discussion

Het toepassingsgebied van dit protocol omvat (i) de omgang met met humane monocyte afgeleide Idc’s en Mdc’s, (II) hun infectie met HSV-1, (III) hun behandeling met verbindingen waarvan bekend is dat ze autophagie remmen, en (IV) hun elektroporation met siRNA met twee verschillende technische opstellingen. Met behulp van het huidige protocol kan autophagic flux worden geblokkeerd in HSV-1-geïnfecteerde Idc’s of worden geïnduceerd in HSV-1-geïnfecteerde Mdc’s.

Aangezien Dc’s, en vooral Idc’s, zeer kwetsbare cellen zijn, is het werken met deze cellen nogal delicate stappen. Voor gelijkstroom generatie raden we aan om vers geïsoleerde PBMCs te gebruiken en om hun cryopreservering te vermijden, om hogere celopbrengsten te verkrijgen. Bovendien, bij het hanteren van Idc’s tijdens experimenten, met inbegrip van de daaropvolgende teelt, voorkomen van harde of langdurige temperatuurveranderingen. Anders kunnen Idc’s fenotypische veranderingen ondergaan en dus is het noodzakelijk om hun onvolgroeide fenotype te verifiëren door Flowcytometrie. Opmerking, in tegenstelling tot hun oudere tegenhangers, idc’s ontbreken verschillende markeringen, zoals CD80, CD83, en CD8628,29. De infectie van idc’s en mdc’s met HSV-1 is een gevestigde methode2,3,4,5,6,10. Wij en anderen toonden aan dat DCs zeer gevoelig is voor HSV-1-infectie, wanneer een MOI van 1 of 2 is gebruikt (Figuur 2). In onze handen, het houden van het volume van de infectie medium op lage niveaus (1-3 x 106 cellen in 250-350 μL) zal leiden tot betere infectie efficiëntie.

Een klassieke aanpak om te interfereren met een gegeven afzonderlijke cellulaire Pathway is het gebruik van specifieke verbindingen. Een verscheidenheid van verschillende modulatoren van autophagy, d.w.z. activatoren en remmers, zijn momenteel beschikbaar30. Met betrekking tot HSV-1-geïnduceerde autophagy in DCs, Turan et al., (2019) toonde onlangs de remmende effecten van spautin-1 en bafilomycine-a1 (BA1) op autophagic omzet in iDCs10. Deze techniek voor autophagie remming is geschikt voor de combinatie met een daaropvolgende HSV-1-infectie, omdat noch de infectie snelheid noch de rijpings status van DCs (vooral Idc’s) is aangetast. In toekomstige toepassingen, deze remmer gebaseerde aanpak kan ook worden toegepast in combinatie met andere infectieuze agentia, stress voorwaarden, zoals honger, evenals voor verschillende celtypen. Echter, bij het gebruik van Remmers, beperkingen ontstaan bij het bepalen van de geschikte concentratie voor efficiënte autophagy remming, zonder ernstige gevolgen voor de levensvatbaarheid van de cel. De belangrijkste beperking bij het gebruik van remmers is echter het vóórkomen van potentiële niet-doel of nadelige effecten, wat kan leiden tot misleidende resultaten31,32.

De tweede aanpak om de autophagie, die in dit protocol wordt behandeld, te verstoren, is de specifieke knockdown met siRNA33,34,35. Aan de ene kant gebruikten we het elektroporation-apparaat I om specifiek de uitdrukking van FIP200 af te breken, waardoor HSV-1-geïnduceerde autophagische omzet in Idc’s werd geremd. Aan de andere kant hebben we twee verschillende Kif-eiwitten (d.w.z. KIF1B en KIF2A) met behulp van het electroporatie-apparaat II gesilenced om autophagische flux in HSV-1-geïnfecteerde mdc’s te vergemakkelijken. Beide elektroporation protocollen resulteerden in een bijna volledige ablatie van FIP200 in Idc’s en KIF1B/KIF2A in Mdc’s, die werd geverifieerd via Western Blot-analyses (Figuur 4a, Figuur 5a). In tegenstelling tot het elektroporation-apparaat I, dat geen invloed heeft op de levensvatbaarheid van Dc’s, leidt elektroporation van Mdc’s met behulp van het elektroporation-apparaat II tot iets hogere percentages dode cellen (Figuur 4b, Figuur 5b ). Vandaar dat in toekomstige toepassingen, het elektroporation apparaat ik bij voorkeur gebruikt moet worden voor zowel iDCs als Mdc’s. Opvallend is dat zowel siRNA-gebaseerde technieken om autophagische flux te moduleren, compatibel zijn met daaropvolgende HSV-1-infectie van Idc’s of Mdc’s. Bovendien wordt noch het onvolgroeide fenotype van Idc’s, noch het volwassen fenotype van Mdc’s na elektroporation gewijzigd.

Elektroporation van Idc’s met behulp van FIP200-specifieke siRNA is een efficiënte en zeer specifieke methode voor gen-knockdown en remming van autophagische flux bij HSV-1-infectie. Naast de specifieke uitschakeling van FIP200, kan dit protocol worden aangepast om andere autophagische componenten stil te leggen, en deel te nemen aan verschillende stappen tijdens de autophagic Cascade. Het identificeren van het juiste streefdoel voor een efficiënte inhibitie van siRNA-gemedieerde van autophagy omvat echter verschillende aspecten van bezorgdheid. Ten eerste is de eliminatie-efficiëntie van autophagy-gerelateerde genen (ATG) niet noodzakelijkerwijs positief correleren met efficiënte remming van autophagie en is sterk afhankelijk van het specifieke ATG-eiwit dat36wordt gesilenced. Ten tweede zijn verschillende ATG-eiwitten bovendien betrokken bij trajecten die losstaan van autophagie, waardoor hun ablatie ook kan leiden tot nadelige neveneffecten37,38,39. Ten derde kunnen verschillende Atg’s redundante functies hebben, waardoor de knockdown van één component mogelijk niet voldoende is om autophagie te remmen (bijv. beclin-1 en beclin-2)40.

Daarnaast is het electroporatie apparaat I-based electroporatie Protocol van DCS ook geschikt voor mrna’s, en kan worden gebruikt voor een verscheidenheid aan extra primaire celtypen, zoals PBMCs25. Dit systeem biedt dus een algemene strategie om verschillende RNA-soorten in verschillende primaire celtypen te leveren. Tot slot presenteren we twee protocollen voor de remming van autophagische flux, door ofwel een remmer-of siRNA-gebaseerde benadering te gebruiken, gecombineerd met daaropvolgende HSV-1-infectie van Idc’s. Verder beschrijven we een siRNA-elektroporation benadering om autophagische flux te induceren in Mdc’s bij HSV-1-infectie.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd gesteund door de Duitse Onderzoeksraad (DFG) via het project STE 432/11-1 uitgereikt aan AS en door het ELAN-programma van de Faculteit Geneeskunde (Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg) via het project 18-12-21-1, toegekend aan LG.

Materials

4D-Nucleofector Core Unit (electroporation apparatus II) Lonza (Basel, Switzerland) AAF-1002B
AB-Serum Sigma Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany) H4522 Dendritic cell cultivation
ACD-A Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany) 9007281
Amaxa P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit L (electroporation kit apparatus II) Lonza (Basel, Switzerland) V4XP-3024
Amersham ECL Prime Western Blotting Detection Reagent GE Healthcare (Solingen, Germany) RPN2232 Western Blot Detection
Ammonium persulfate (APS) Sigma Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany) A3678
anti-mouse-IgG (mouse, polyclonal, HRP) Cell Signaling (Leiden, Netherlands) 7076 Western Blot detection
anti-rabbit-IgG (goat, polyclonal, HRP) Cell Signaling (Leiden, Netherlands) 7074 Western Blot detection
Bafilomycin A1 Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany) tlrl-baf1 inhibition of autophagy and lysosomal degradation
BD FACS Canto II Flow Cytometer BD Biosciences (Heidelberg, Germany) 338962
Benzonase Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany) E1014
Blotting Chamber Fastblot B44 Biometra (Göttingen, Germany) 846-015-100
CCR7 (mouse, Pe-Cy7) BioLegend (Fell, Germany) 557648 Flow cytometry
Dilution: 1:100
Clone: G043H7
CD11c (mouse, Pe-Cy5) BD Biosciences (Heidelberg, Germany) 561692 Flow cytometry
Dilution: 1:100
Clone: B-ly6
CD14 (mouse, PE) BD Biosciences (Heidelberg, Germany) 555398 Flow cytometry
Dilution: 1:100
Clone: M5E2
CD3 (mouse, FITC) BD Biosciences (Heidelberg, Germany) 555332 Flow cytometry
Dilution: 1:100
Clone: UCHT1
CD80 (mouse, V450) BD Biosciences (Heidelberg, Germany) 560442 Flow cytometry
Dilution: 1:100
Clone: L307.4
CD83 (mouse, APC) eBioscience Thermo Fisher Scientific (Langenselbold, Germany) 17-0839-41 Flow cytometry
Dilution: 1:200
Clone: HB15e
CD86 (mouse, PE) BD Biosciences (Heidelberg, Germany) 553692 Flow cytometry
Dilution: 1:100
EVOS FL Cell Imaging System AMG/Life Technologies (Carlsbad, USA) AMF4300
FIP200 (rabbit) Cell Signaling (Leiden, Netherlands) 12436 Western Blot detection
Dilution: 1:1000
Clone: D10D11
GAPDH (mouse) Merck Millipore (Massachusetts, USA) AB2302 Western Blot detection
Dilution: 1:5000
Clone: MAB374
Gene Pulser II apparatus (electroporation apparatus I) BioRad Laboratories GmbH (München, Germany) 165-2112
GM-CSF (4×104 U/mL) Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, Germany) 130-093-868
HLA‐DR (mouse, APC-Cy7) BioLegend (Fell, Germany) 307618 Flow cytometry
Dilution: 1:200
Clone: L243
HSV-1/17+/CMV-EGFP/UL43 BioVex DC infection
 
ICP0 (mouse) Santa Cruz Biotechnology (St. Cruz; Dallas, Texas, USA) sc-53070 Western Blot detection
Dilution: 1:1000
Clone: 11060
ICP5 (mouse) Santa Cruz Biotechnology (St. Cruz; Dallas, Texas, USA) sc-56989 Western Blot detection
Dilution: 1:1000
Clone: 3B6
IL-1β (0.1×106 U/mL) Cell Genix GmbH (Freiburg, Germany) 1411-050
IL-4 (1×106 U/mL) Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, Germany) 130-093-924
IL-6 (1×106 U/mL) Cell Genix GmbH (Freiburg, Germany) 1404-050
ImageQuant LAS 4000 GE Healthcare (Solingen, Germany) 28955810
KIF1B (mouse) Santa Cruz Biotechnology (St. Cruz; Dallas, Texas, USA) sc-376246 Western Blot detection
Dilution: 1:1000
Clone: E-12
KIF2A (mouse) Santa Cruz Biotechnology (St. Cruz; Dallas, Texas, USA) sc-271471 Western Blot detection
Dilution: 1:1000
Clone: D-7
LC3B (rabbit) Cell Signaling (Leiden, Netherlands) 3868 Western Blot detection
Dilution: 1:1000
Clone: D11
L-glutamine Lonza (Basel, Switzerland) 17-605E
LIVE/DEAD Fixable Violet dead cell stain kit Life Technologies (Carlsbad, CA, USA) L34964 L/D staining in Flow cytometry
Lymphoprep Alere Technologies AS (Oslo, Norway) 04-03-9391/01
Magnesiumchloride Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany) A537.1
Megafuge 2.0 RS Heraeus (Hanau, Germany) 75015505
N, N, N', N'-Tetramethylethylendiamine (TEMED) Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany) T9281
Neubauer counting chamber Brand (Wertheim, Germany) 717805
Nunc Cell culture flasks (175.0 cm2) Thermo Scientific (Rockford, USA) 159910
p62 (rabbit) Cell Signaling (Leiden, Netherlands) 88588 Western Blot detection
Dilution: 1:1000
Clone: D5L7G
PageRuler prestained protein ladder Thermo Fisher Scientific (Langenselbold, Germany) 26616
Paraformaldehyde, 16 % Alfa Aesar, Haverhill, USA 43368.9M
PerfectSpin 24 Plus Peqlab (Erlangen, Germany) C2500-R-PL
PGE2 (1 mg/mL) Pfizer (Berlin, Germany) BE130681
Phosphate buffered saline (PBS) Lonza (Basel, Switzerland) 17-512F
Protein gel system MiniProtean II Bio-Rad Laboratories GmbH (München, Germany) 1652960
RestoreTM Western Blot Stripping Buffer Thermo Scientific, Rockford, USA 21059
Rocking Platform wt 15 Biometra (Göttingen, Germany) 042-590
RotiBlock Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany) A151.4
Roti-Load 1 (4x) Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany) K929.3
Rotiphorese Gel 30 (37.5:1) Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany) 3029.1
RPMI 1640 Lonza (Basel, Switzerland) 12-167F
Sodium dodecyl Sulfate (SDS) Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany) 2326.2
Thermomixer comfort Eppendorf (Hamburg, Germany) 5355 000.011
TNF-α (10 μg/mL) Peprotech (Hamburg, Germany) 300-01A
Tris Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany) 4855.3
Trypan blue solution (0.4 %) Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany) T8154
Tween 20 Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany) 9127.1
Whatman 0.2 μm nitrocellulose membrane GE Healthcare (Solingen, Germany) 10600001
WhatmanTM Chromatography Paper 3 mm Chr Fisher Scientific GmbH (Schwerte, Germany) 3030917
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chapuis, F., Rosenzwajg, M., Yagello, M., Ekman, M., Biberfeld, P., Gluckman, J. C. Differentiation of human dendritic cells from monocytes in vitro. European Journal of Immunology. 27 (2), 431-441 (1997).
  2. Kummer, M., et al. Herpes simplex virus type 1 induces CD83 degradation in mature dendritic cells with immediate-early kinetics via the cellular proteasome. Journal of Virology. 81 (12), 6326-6338 (2007).
  3. Kruse, M., et al. Mature dendritic cells infected with herpes simplex virus type 1 exhibit inhibited T-cell stimulatory capacity. Journal of Virology. 74 (15), 7127-7136 (2000).
  4. Salio, M., Cella, M., Suter, M., Lanzavecchia, A. Inhibition of dendritic cell maturation by herpes simplex virus. European Journal of Immunology. 29 (10), 3245-3253 (1999).
  5. Prechtel, A. T., et al. Infection of mature dendritic cells with herpes simplex virus type 1 dramatically reduces lymphoid chemokine-mediated migration. Journal of General Virology. 86, 1645-1657 (2005).
  6. Theodoridis, A. A., Eich, C., Figdor, C. G., Steinkasserer, A. Infection of dendritic cells with herpes simplex virus type 1 induces rapid degradation of CYTIP, thereby modulating adhesion and migration. Blood. 118 (1), 107-115 (2011).
  7. Cohrs, R. J., Gilden, D. H. Human herpesvirus latency. Brain Pathology. 11 (4), 465-474 (2001).
  8. Grinde, B. Herpesviruses: latency and reactivation – viral strategies and host response. Journal of Oral Microbiology. 5, (2013).
  9. Whitley, R. J., Roizman, B. Herpes simplex virus infections. The Lancet. 357 (9267), 1513-1518 (2001).
  10. Turan, A., et al. Autophagic degradation of lamins facilitates the nuclear egress of herpes simplex virus type 1. The Journal of Cell Biology. 218 (2), 508-523 (2019).
  11. Takeshige, K., Baba, M., Tsuboi, S., Noda, T., Ohsumi, Y. Autophagy in yeast demonstrated with proteinase-deficient mutants and conditions for its induction. The Journal of Cell Biology. 119 (2), 301-311 (1992).
  12. Yin, Z., Pascual, C., Klionsky, D. J. Autophagy: machinery and regulation. Microbial Cell. 3 (12), 588-596 (2016).
  13. Bodemann, B. O., et al. RalB and the exocyst mediate the cellular starvation response by direct activation of autophagosome assembly. Cell. 144 (2), 253-267 (2011).
  14. Bjorkoy, G., et al. p62/SQSTM1 forms protein aggregates degraded by autophagy and has a protective effect on huntingtin-induced cell death. The Journal of Cell Biology. 171 (4), 603-614 (2005).
  15. Kabeya, Y., et al. LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing. The EMBO Journal. 19 (21), 5720-5728 (2000).
  16. Kabeya, Y., Mizushima, N., Yamamoto, A., Oshitani-Okamoto, S., Ohsumi, Y., Yoshimori, T. LC3, GABARAP and GATE16 localize to autophagosomal membrane depending on form-II formation. Journal of Cell Science. 117, 2805-2812 (2004).
  17. Pankiv, S., et al. p62/SQSTM1 binds directly to Atg8/LC3 to facilitate degradation of ubiquitinated protein aggregates by autophagy. The Journal of Biological Chemistry. 282 (33), 24131-24145 (2007).
  18. Korolchuk, V. I., Rubinsztein, D. C. Regulation of autophagy by lysosomal positioning. Autophagy. 7 (8), 927-928 (2011).
  19. Li, Y., et al. A cell-based quantitative high-throughput image screening identified novel autophagy modulators. Pharmacological Research. 110, 35-49 (2016).
  20. Pampaloni, F., et al. A Novel Cellular Spheroid-Based Autophagy Screen Applying Live Fluorescence Microscopy Identifies Nonactin as a Strong Inducer of Autophagosomal Turnover. SLAS Discovery. 22 (5), 558-570 (2017).
  21. Deng, Y., Zhu, L., Cai, H., Wang, G., Liu, B. Autophagic compound database: A resource connecting autophagy-modulating compounds, their potential targets and relevant diseases. Cell Proliferation. 51 (3), 12403 (2018).
  22. Liu, J., et al. Beclin1 controls the levels of p53 by regulating the deubiquitination activity of USP10 and USP13. Cell. 147 (1), 223-234 (2011).
  23. Mauvezin, C., Neufeld, T. P. Bafilomycin A1 disrupts autophagic flux by inhibiting both V-ATPase-dependent acidification and Ca-P60A/SERCA-dependent autophagosome-lysosome fusion. Autophagy. 11 (8), 1437-1438 (2015).
  24. Yoshimori, T., Yamamoto, A., Moriyama, Y., Futai, M., Tashiro, Y. Bafilomycin A1, a specific inhibitor of vacuolar-type H(+)-ATPase, inhibits acidification and protein degradation in lysosomes of cultured cells. Journal of Biological Chemistry. 266 (26), 17707-17712 (1991).
  25. Gerer, K. F., Hoyer, S., Dorrie, J., Schaft, N. Electroporation of mRNA as Universal Technology Platform to Transfect a Variety of Primary Cells with Antigens and Functional Proteins. Methods in Molecular Biology. 1499, 165-178 (2017).
  26. Prechtel, A. T., Turza, N. M., Theodoridis, A. A., Steinkasserer, A. CD83 knockdown in monocyte-derived dendritic cells by small interfering RNA leads to a diminished T cell stimulation. The Journal of Immunology. 178 (9), 5454-5464 (2007).
  27. Pfeiffer, I. A., et al. Leukoreduction system chambers are an efficient, valid, and economic source of functional monocyte-derived dendritic cells and lymphocytes. Immunobiology. 218 (11), 1392-1401 (2013).
  28. Villadangos, J. A., Heath, W. R. Life cycle, migration and antigen presenting functions of spleen and lymph node dendritic cells: limitations of the Langerhans cells paradigm. Seminars in Immunology. 17 (4), 262-272 (2005).
  29. Lechmann, M., Berchtold, S., Hauber, J., Steinkasserer, A. CD83 on dendritic cells: more than just a marker for maturation. Trends in Immunology. 23 (6), 273-275 (2002).
  30. Yang, Y. P., et al. Application and interpretation of current autophagy inhibitors and activators. Acta Pharmacologica Sinica. 34 (5), 625-635 (2013).
  31. Redmann, M., et al. Inhibition of autophagy with bafilomycin and chloroquine decreases mitochondrial quality and bioenergetic function in primary neurons. Redox Biology. 11, 73-81 (2017).
  32. Yan, Y., et al. Bafilomycin A1 induces caspase-independent cell death in hepatocellular carcinoma cells via targeting of autophagy and MAPK pathways. Scientific Reports. 6, 37052 (2016).
  33. Hale, C. M., et al. Identification of modulators of autophagic flux in an image-based high content siRNA screen. Autophagy. 12 (4), 713-726 (2016).
  34. Lipinski, M. M., et al. A genome-wide siRNA screen reveals multiple mTORC1 independent signaling pathways regulating autophagy under normal nutritional conditions. Developmental Cell. 18 (6), 1041-1052 (2010).
  35. Orvedahl, A., et al. Image-based genome-wide siRNA screen identifies selective autophagy factors. Nature. 480 (7375), 113-117 (2011).
  36. Staskiewicz, L., Thorburn, J., Morgan, M. J., Thorburn, A. Inhibiting autophagy by shRNA knockdown: cautions and recommendations. Autophagy. 9 (10), 1449-1450 (2013).
  37. Lee, I. H., et al. Atg7 modulates p53 activity to regulate cell cycle and survival during metabolic stress. Science. 336 (6078), 225-228 (2012).
  38. Fremont, S., Gerard, A., Galloux, M., Janvier, K., Karess, R. E., Berlioz-Torrent, C. Beclin-1 is required for chromosome congression and proper outer kinetochore assembly. EMBO Reports. 14 (4), 364-372 (2013).
  39. Bestebroer, J., V’kovski, P., Mauthe, M., Reggiori, F. Hidden behind autophagy: the unconventional roles of ATG proteins. Traffic. 14 (10), 1029-1041 (2013).
  40. Galluzzi, L., Kroemer, G. Common and divergent functions of Beclin 1 and Beclin 2. Cell Research. 23 (12), 1341-1342 (2013).

Tags

SiRNAElectroporationAutophagyHerpes Simplex Virus Type 1Monocyte-derived Dendritic CellsAutophagy InhibitorsSpautin-1Bafilomycin A1HSV-1 Infection

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Düthorn, A., Turan, A., Draßner, C., Mühl-Zürbes, P., Heilingloh, C. S., Steinkasserer, A., Grosche, L. siRNA Electroporation to Modulate Autophagy in Herpes Simplex Virus Type 1-Infected Monocyte-Derived Dendritic Cells. J. Vis. Exp. (152), e60190, doi:10.3791/60190 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image