בידוד של לוקיולוציטים מחלב השד האנושי לשימוש בנוגדן-מותנה תאית הסלולר שיטת מטרות HIV
Summary
חלב אם מעביר וירוס הכשל החיסוני האנושי (HIV), אם כי רק ~ 15% של תינוקות היונקים על ידי אמהות מזוהמת HIV להידבק. תינוקות החושן לבלוע ~ 105על 10שמונה לוקיציטים אימהי מדי יום, למרות תאים אלה אינם לומדים. כאן אנו מתארים את הבידוד של חלב לוקיולוציטים וניתוח של קיבולת phagocytic שלהם.
Abstract
גם בהעדר תרופות אנטי-ויראליות, רק ~ 15% של תינוקות היונקים על ידי אמהות שנדבקו ב-HIV להידבק, מציע השפעה הגנה חזקה של חלב (BM). אלא אם כן הגישה למים נקיים ונוסחת התינוק המתאימה אמינה, האדם אינו ממליץ על הפסקת ההנקה לאמהות הנגועות באיידס. גורמים רבים נוטים לעבוד במקביל כדי להפחית את השידור BM. תינוקות החושן לבלוע ~ 105על 108 שמונה לוקיציטים היומיום, למרות מה שנשאר ברור במידה רבה הוא התרומה של תאים אלה לאיכויות האנטי ויראליות של BM. כעת כיוונו לבודד תאים מתוך מוניטור האדם כדי למדוד נוגדן תלוי phagocyציטוזה הסלולר (ADCP), אחד התגובות החיוניות ביותר ומחוצה המערכת החיסונית, על ידי BM phagocytes נגד מטרות HIV. תאים היו מבודדים 5 האדם דגימות BM התקבל בשלבים שונים של ההנקה. בידוד נעשה באמצעות צנטריפוגה עדין ואחריו הסרה זהירה של שומן חלב ושטיפת חוזר של הגלולה התא. חרוזים פלורסנט מצופה מעטפת HIV (Env) אפירופה שימשו כמטרות ניתוח של ADCP. תאים היו מוכתמים עם סמן פני השטח CD45 כדי לזהות את הלוקוציטים. נמצא כי הפעילות ADCP היה משמעותי מעל ניסויים בקרה ומדידה הנידובית באמצעות נוגדן ספציפי HIV 830A.
Introduction
חלב האדם (BM) מורכב של תאים אמהי כי הם > 90% קיימא1. הרכב התא מושפע באופן חזק על ידי שלב של הנקה, מעמד הבריאות של האם והתינוק, וריאציה אינדיבידואלית, אשר נשאר מובן בצורה גרועה1,2,3,4. בהינתן כי מוניטור מכיל ~ 103על 105 לוקיציטים/mL, זה יכול להיות מוערך כי תינוקות החזה לבלוע ~ 105על 10שמונה לוקיולוציטים היומי5. שונים במחקרים vivo הוכיחו כי לוקיציטים אימהי לספק חסינות קריטית לתינוק והם פונקציונליים היטב מעבר לאתרים אלה של בליעה ראשונית5,6,7,8 ,9,10,11. כל התאים הmaternally שבלע התינוק יש את הפוטנציאל לבצע פונקציות החיסון לצד או לפצות על לוקיציטים של התינוק12.
העברת אמא אל הילד (MTCT) של נגיף הכשל החיסוני האנושי (HIV) נשאר משבר במדינות מוגבלות משאבים. כdiarrheal ומחלות הנשימה אחראים לשיעורי התמותה הניכרים בקרב תינוקות במדינות מוגבלות משאבים, ומחלות אלה מופחתות באופן משמעותי על ידי הנקה בלעדית, את היתרונות לאמהות הנגועות באיידס של הנקה הרבה עולה על הסיכונים13,14,15. אלא אם כן הגישה למים נקיים ונוסחת התינוק המתאימה היא אמינה, האדם אינו ממליץ על הפסקת ההנקה לאמהות הנגועות באיידס16. כ 100,000 בקירוב באמצעות BM מתרחשים מדי שנה; עם זאת, רק ~ 15% של תינוקות היונקים על ידי האמהות שלהם הנגועים באיידס להידבק, מציע אפקט הגנה חזקה של BM17,18,19,20,21. גורמים רבים נוטים לעבוד במשולב כדי למנוע שידור. חשוב מכך, נוגדנים ספציפיים ל-HIV (Abs) ב-BM יש קורלציה עם mtct מופחת ו/או מופחת תינוק מוות מזיהום HIV22,23. מה שנשאר בלתי ברור הוא התרומה של החלק הסלולרי של BM לאיכויות האנטי ויראליות שלה.
Abs רבים להקל על מגוון של פעילויות אנטי ויראליות בתיווך על ידי האזור ‘ קבוע ‘ של מולקולה האימונוגלובולין, הקטע crystallizable (Fc), באמצעות אינטראקציה עם קולטני Fc (FcRs) נמצא על כמעט כל התאים החיסוניים מולדים, כמעט כל אשר נמצאים האדם BM24. נוגדן תלויי תאי הסלולר (adcp) כבר הוכח כנדרש עבור הסיווג של זיהומים ויראלי כבר למדו במקרה של מניעת mtct של HIV25,26,27, מיכל בן 28 , 29. בהינתן דלות של הידע על התרומה הפוטנציאלית של פעילות adcp על ידי BM phagocytes למניעת mtct של HIV, אנחנו כיוונו לפתח שיטה קפדנית לבודד תאים מתוך מוניטור אנושי על מנת לבצע מחקר של adcp מתווכת על ידי תאים מ BM התקבל בשלבים שונים של הנקה.
Protocol
Representative Results
Discussion
את הטכניקה מבוססי הזרימה cy, למדידת פעילות ADCP שתוארה לעיל תוארה לראשונה ב 201130 , מאז הוכח חזק מצוטט ביותר מ 80 לימודים. הפרוטוקול המתואר כאן מתאים את הטכניקה לשימוש עם תאי BM ראשיים בפעם הראשונה. המחקרים הקודמים של Fc-בתיווך פונקציונליות על ידי התאים BM היו מוגבלים במידה רבה למדידה ש?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לד ר סוזאן זוללה-פזנר במחלקה לרפואה ומחלקת מיקרוביולוגיה בבית הספר לרפואה ע שלמה בהר סיני לסקירה כתבי יד. NIH/ניקולה סיפק מימון לפרויקט זה תחת המענק מספר R21 HD095772-01A1. בנוסף, היתה למשרד המחלקה לרפואה מחלקת מחלות זיהומיות, בית הספר לרפואה ע ר Icahn בהר סיני.
Materials
| 1 µm FluoSpheres NeutrAvidin-Labeled Microspheres | Thermo Fisher | F8776 | |
| BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD45 | BD | 560975 | |
| Bovine serum Albumin | MP Biomedicals | 8810025 | |
| Corning V-bottom polystyrene 96-well plate | Corning | 3894 | |
| Cytochalasin D | Sigma | 22144-77-0 | |
| EZ-Link NHS-LC-LC-Biotin kit | Thermo Fisher | 21338 | |
| Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352196 | |
| Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352070 | |
| Fixable Viability Stain 450 | BD | 562247 | |
| Formaldehyde solution | Sigma | 252549 | |
| HBSS without Calcium, Magnesium or Phenol Red | Life Technologies | 14175-095 | |
| Human BD Fc Block | BD | 564219 | |
| Human Serum Albumin | MP Biomedicals | 2191349 | |
| Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark Professional | 34120 | |
| PBS 1x pH 7.4 | Thermo Fisher | 10010023 | |
| Polystyrene 10mL Serological Pipettes | Corning | 4488 | |
| Protein Concentrators PES, 3K MWCO, 0.5 mL | Pierce | 88512 |
References
- Hassiotou, F., Geddes, D. T., Hartmann, P. E. Cells in human milk: state of the science. Journal of Human Lactation. 29 (2), 171-182 (2013).
- Lonnerdal, B. Nutritional and physiologic significance of human milk proteins. The American Journal of Clinical Nutrition. 77 (6), 1537S-1543S (2003).
- Butte, N. F., Garza, C., Stuff, J. E., Smith, E. O., Nichols, B. L. Effect of maternal diet and body composition on lactational performance. The American Journal of Clinical Nutrition. 39 (2), 296-306 (1984).
- Dewey, K. G., Finley, D. A., Lonnerdal, B. Breast milk volume and composition during late lactation (7-20 months). Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 3 (5), 713-720 (1984).
- Hassiotou, F., Geddes, D. T. Immune cell-mediated protection of the mammary gland and the infant during breastfeeding. Advances in Nutrition. 6 (3), 267-275 (2015).
- Hanson, L. A. The mother-offspring dyad and the immune system. Acta Paediatrica. 89 (3), 252-258 (2000).
- Wirt, D. P., Adkins, L. T., Palkowetz, K. H., Schmalstieg, F. C., Goldman, A. S. Activated and memory T lymphocytes in human milk. Cytometry. 13 (3), 282-290 (1992).
- Jain, L., et al. In vivo distribution of human milk leucocytes after ingestion by newborn baboons. Archives of Disease in Childhood. 64 (7 Spec No), 930-933 (1989).
- Zhou, L., et al. Two independent pathways of maternal cell transmission to offspring: through placenta during pregnancy and by breast-feeding after birth. Immunology. 101 (4), 570-580 (2000).
- Tuboly, S., Bernath, S. Intestinal absorption of colostral lymphoid cells in newborn animals. Advances in Experimental Medicine and Biology. 503, 107-114 (2002).
- Cabinian, A., et al. Transfer of Maternal Immune Cells by Breastfeeding: Maternal Cytotoxic T Lymphocytes Present in Breast Milk Localize in the Peyer’s Patches of the Nursed Infant. PLoS ONE. 11 (6), e0156762 (2016).
- Filias, A., et al. Phagocytic ability of neutrophils and monocytes in neonates. BMC Pediatrics. 11, 29 (2011).
- Natchu, U. C., et al. Exclusive breastfeeding reduces risk of mortality in infants up to 6 mo of age born to HIV-positive Tanzanian women. The American Journal of Clinical Nutrition. 96 (5), 1071-1078 (2012).
- Dewey, K. G., Heinig, M. J., Nommsen-Rivers, L. A. Differences in morbidity between breast-fed and formula-fed infants. The Journal of Pediatrics. 126 (5 Pt 1), 696-702 (1995).
- WHO. Collaborative Study Team on the Role of Breastfeeding on the Prevention of Infant Mortality. Effect of breastfeeding on infant and child mortality due to infectious diseases in less developed countries: a pooled analysis. Lancet. 355 (9202), 451-455 (2000).
- World Health Organization. Updates on HIV and Infant Feeding: The Duration of Breastfeeding, and Support from Health Services to Improve Feeding Practices Among Mothers Living with HIVWHO Guidelines Approved by the Guidelines Review Committee. World Health Organization. , (2016).
- Nelson, C. S., et al. Combined HIV-1 Envelope Systemic and Mucosal Immunization of Lactating Rhesus Monkeys Induces a Robust Immunoglobulin A Isotype B Cell Response in Breast Milk. Journal of Virology. 90 (10), 4951-4965 (2016).
- Fowler, M. G., Lampe, M. A., Jamieson, D. J., Kourtis, A. P., Rogers, M. F. Reducing the risk of mother-to-child human immunodeficiency virus transmission: past successes, current progress and challenges, and future directions. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 197 (3 Suppl), S3-S9 (2007).
- Shen, R., et al. Mother-to-Child HIV-1 Transmission Events Are Differentially Impacted by Breast Milk and Its Components from HIV-1-Infected Women. PLoS ONE. 10 (12), e0145150 (2015).
- Fouda, G. G., et al. HIV-specific functional antibody responses in breast milk mirror those in plasma and are primarily mediated by IgG antibodies. Journal of Virology. 85 (18), 9555-9567 (2011).
- Van de Perre, P., et al. HIV-1 reservoirs in breast milk and challenges to elimination of breast-feeding transmission of HIV-1. Science Translational Medicine. 4 (143), 143sr143 (2012).
- Milligan, C., Richardson, B. A., John-Stewart, G., Nduati, R., Overbaugh, J. Passively acquired antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) activity in HIV-infected infants is associated with reduced mortality. Cell Host & Microbe. 17 (4), 500-506 (2015).
- Pollara, J., et al. Association of HIV-1 Envelope-Specific Breast Milk IgA Responses with Reduced Risk of Postnatal Mother-to-Child Transmission of HIV-1. Journal of Virology. 89 (19), 9952-9961 (2015).
- Ackerman, M., Nimmerjahn, F. . Antibody Fc. , (2014).
- Huber, V. C., Lynch, J. M., Bucher, D. J., Le, J., Metzger, D. W. Fc receptor-mediated phagocytosis makes a significant contribution to clearance of influenza virus infections. Journal of Immunology. 166 (12), 7381-7388 (2001).
- Fujisawa, H. Neutrophils play an essential role in cooperation with antibody in both protection against and recovery from pulmonary infection with influenza virus in mice. Journal of Virology. 82 (6), 2772-2783 (2008).
- Chung, K. M., Thompson, B. S., Fremont, D. H., Diamond, M. S. Antibody recognition of cell surface-associated NS1 triggers Fc-gamma receptor-mediated phagocytosis and clearance of West Nile Virus-infected cells. Journal of Virology. 81 (17), 9551-9555 (2007).
- Yasui, F., et al. Phagocytic cells contribute to the antibody-mediated elimination of pulmonary-infected SARS coronavirus. Virology. 454-455, 157-168 (2014).
- Quattrocchi, V., et al. Role of macrophages in early protective immune responses induced by two vaccines against foot and mouth disease. Antiviral Research. 92 (2), 262-270 (2011).
- Ackerman, M. E., et al. A robust, high-throughput assay to determine the phagocytic activity of clinical antibody samples. Journal of Immunological Methods. 366 (1-2), 8-19 (2011).
- Jiang, X., et al. Rationally Designed Immunogens Targeting HIV-1 gp120 V1V2 Induce Distinct Conformation-Specific Antibody Responses in Rabbits. Journal of Virology. 90 (24), 11007-11019 (2016).
- Sanders, R. W., et al. A next-generation cleaved, soluble HIV-1 Env trimer, BG505 SOSIP.664 gp140, expresses multiple epitopes for broadly neutralizing but not non-neutralizing antibodies. PLoS Pathogens. 9 (9), e1003618 (2013).
- Im, M., et al. Comparative quantitative analysis of cluster of differentiation 45 antigen expression on lymphocyte subsets. The Korean Journal of Laboratory Medicine. 31 (3), 148-153 (2011).
- Trend, S., et al. Leukocyte Populations in Human Preterm and Term Breast Milk Identified by Multicolour Flow Cytometry. PLoS ONE. 10 (8), e0135580 (2015).
- Buescher, E. S., McIlheran, S. M. Polymorphonuclear leukocytes and human colostrum: effects of in vivo and in vitro exposure. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 17 (4), 424-433 (1993).
- Franca, E. L., et al. Human colostral phagocytes eliminate enterotoxigenic Escherichia coli opsonized by colostrum supernatant. Journal of Microbiology, Immunology and Infection. 44 (1), 1-7 (2011).
