巢穴建筑行为作为小鼠行为缺陷的早期指标

所有程序均获得乔治梅森大学动物护理和使用委员会的批准，并符合实验室动物护理评估和认证所规定的准则。 1. 评估前的动物和注意事项 对于此协议，使用成人，9 – 12 个月大的 C57BL/6J （n = 10） （股票 # 000664） 野生型小鼠和 APOE e4 小鼠（n = 11） 从半胱氨酸 J20 （股票#006293） x 同源性 APOE e4 （股票#012307） 交叉。 在住房室里，群屋老鼠与同性杂物适当富集（例如，对于这个协议，老鼠被提供了一个运行轮，冰屋和一个小尼龙咀嚼玩具）。组屋 4 – 6 雌性小鼠和 4 雄性在 356 毫米 L x 485 毫米 W x 218 毫米 H 家庭笼。注：研究人员可以考虑在筑巢之前和/或之后实施策略，以避免在筑巢试验后小鼠重新引入时发生笼友攻击。这种策略可以包括但不限于行为测试前的日常处理，以更好地适应小鼠在行为测试期间的处理，研究人员和畜牧工作人员19，分离和单独安置攻击性小鼠，或减少家笼20的老鼠数量，视乎笼内搏斗的严重程度，观察伤口21等。 2. 房间和嵌套设置 确保每只鼠标完成四次试验（每次试验 1 个材料）。随机化每只鼠标的嵌套材质的顺序，以避免顺序效果。 在单独的测试室准备笼子。记录环境条件（例如，22.2 – 22.3°C，45-47% 湿度，上午 9：00 至晚上 9：00 的照明），以便它们在整个试验中一致且与外壳相同。提供食物和水。 为每个鼠标分配一个随机标识 （ID） 编号或字母。将随机标识符卡连接到 29.2 x 18.4 厘米的保持架上。 将原始动物ID/标签和其他必要的身份证明记录在殖民地记录中，以确保助理和畜牧工作人员对条件视而不见。 随机排列在测试室中的笼子放置，使野生型小鼠和转基因小鼠不会被不当分离（即，在房间的对面，在单独的架子上，等等）。 通过充分覆盖笼子底部来准备嵌套材料。使用约 100 g 干重的玉米棒床上用品进行方形、扭曲和切碎的纸张试验，以及约 100 g 的软棒床上用品进行软棒试验。 如果使用烧杯来分散嵌套材料，则用玉米棒床上用品或软棒床上用品填充烧杯不超过 100 mL。 在将鼠标引入笼子之前，将第一个嵌套材料放入序列中。该协议使用 （1） 单压棉方形，（2） 单纸张扭曲，（3） 100g 软焦布床上用品（即，没有添加额外的床上用品或嵌套材料），和 （4） 2.5 g 清洁（无墨水），切碎的白色打印机纸张切成 5 × 7 厘米条。分散嵌套材料，如图1所示（基线）。 图1：每种材料的笼子设置。所有小鼠完成一项试验，每种类型的材料共四次试验。玉米被子在笼子的整个底部衬里，里面装着纸扭曲、压棉方形和碎纸。软棒床上用品均匀地分散在笼子里，以鼓励老鼠将小棉方块从玉米棒中分离出来。请点击此处查看此图的较大版本。 3. 嵌套试验 在光周期开始时（例如，上午 9：00）的同一时间开始第一个嵌套试验。 把装有老鼠的家笼带进测试室。将每只鼠标从家庭笼中取出，并将其放入其指定的嵌套笼中，并将材料放入笼子中。把家里的笼子还到房里。 让小鼠完成1次试验，24小时不受干扰。 第一次试验开始后24小时，返回测试室。 小心地取下笼子的盖子，拍摄每只老鼠的巢穴，在照片中捕获分配的 ID，并尽量减少笼子外任何材料的外观。注： 等待鼠标移出网箱，然后再尝试将其从笼子中取出。强烈建议在鼠标在笼子里但离开鸟巢时拍摄鸟巢。在拍摄前尝试将鼠标从笼子中取出可能会导致鼠标被吓了一步，从而在嵌套材料的顶部移动并分散。 轻轻地将鼠标从嵌套笼中取出，并将其放入临时保持笼中。处置床上用品和任何嵌套材料，替换床上用品，在序列中提供下一个嵌套材料，并将鼠标返回到嵌套保持架。 根据需要重复，以获得所有 4 项试验的分数。建议使用切碎的纸张和随附的评分标准，尽管研究人员可能有兴趣使用本协议中讨论的替代材料。 当所有试验完成后，将老鼠送回其家的笼子。观察小鼠是否有任何潜在的攻击行为。侵略可能发生在较老的野生型雄性。注：就本协议而言，小鼠在大约9~12个月大时进行了一次测试。筑巢应在几个年龄进行（即，在较早的年龄，取决于选择的菌株，在出现型型特征之前），以记录筑巢能力随时间而下降，并证明神经退化的可能致病作用。 4. 评分和评估评审员之间的可靠性 向至少2名对研究视而不见的人提供每个嵌套材料的基线图像。虽然不是必需的，但请确保评分员熟悉嵌套的概念。训练记分器时，提供一系列示例嵌套（例如，粉碎纸的图 2），以便记分员熟悉每种类型的材料（如果适用）和评分标准。 使用以下比例信息（改编自 Deacon，2006 ） 以 1 + 5 的比例评估每个巢。参见图 2，作为使用切碎的纸张进行评分的示例。 当碎纸或小方块散落在笼子里，或棉方或扭曲未动时，分配1分; 当某些材料被构造成巢时，分配 2 的分数，但超过 50% 的材料未用于筑巢（即保持零散或大部分原始材料未受影响）; 当构造一个明显的巢时，分配 3 的分数，但几个部分仍然分散; 当几乎所有的材料都用于鸟巢时，分配4分，但很少有材料仍然分散或靠近鸟巢; 当所有材料都用于创建可识别的嵌套时，分配 5 的分数。注：记分员应休息并重温基线照片，以避免在评分过程中出现疲劳和偏见。得分手不应相互讨论分数以避免偏见。得分者应在评分完成后讨论分数，或者如果需要进一步讨论以更改分数，这有可能解决与类内关联 （ICC） 有关的问题。类内关联将使用第 4.2 节中列出的步骤进行。 图2：使用切碎纸的标准进行评分的示例，这是首选材料。从左到右：1 = 切碎的纸张保持不变;2 – 一些纸张被建成一个巢，但大多数碎片仍然散落;3 = 建造了一个明显的巢穴，但几块仍然散落着;4 = 大多数碎片用于鸟巢，但有些碎片散落在鸟巢附近;5 = 所有部分都用于制造巢穴。请注意，在照片中，显示动物的指定编号以避免无盲。卡片的颜色是随机的。研究人员应该允许老鼠留在笼子里，以避免老鼠惊异，因为老鼠可能会分散巢穴。请点击此处查看此图的较大版本。 收集和输入分数并格式化数据文件，以便每个材料的每个评分的分数都位于单独的列中。注：如果使用补充文件1，请注意，此分析的编码脚本需要免费的开源软件（例如，RStudio 中的irr软件包）22、23。该脚本删除标头和主题变量（即顶行和动物代码），以执行类内关联 （ICC）。运行脚本以执行双向协议、平均度量 ICC，方法是突出显示代码的已分界部分并点击 Ctrl_Enter 或命令 +Enter。 将国际商会与现行准则24、25、26作比较。通常，高于 0.80 的 ICC 值对应于强大的评分者间可靠性，证明分数在给定时间点（补充文件 2） 中求平均值是合理的。 对内部评分者可靠性使用相同的 ICC 标准，对于首次进行评分的人可能有兴趣。注意：记分员应在初步评估后的一周内对相同的照片巢穴进行评分。当 ICC 低时，请谨慎使用平均数据，因为这可能会扭曲数据或生成无效结果。如果 ICC 值较低，则 （1） 可能需要为记分者进行额外培训，（2） 记分者可能需要讨论其对巢分数的推理，（3） 可能需要另一个独立审查员对分数做出判断，或 （4） 内部评分员可靠性可能需要评估。如果内部评分员的可靠性较差，则可能需要额外培训或不同的评分器。 5. 统计考虑因素 酌情进行统计分析。对于不违反正常性假设但为每个鼠标使用多个材料的数据（即主体内效应），请使用方差混合分析 （ANOVA）。 如果使用作为补充文件提供的代码，请下载脚本27、28、29、30中指定的其他加载项包。 如果使用提供的脚本执行混合 ANOVA，请运行脚本以将任何宽格式数据文件转换为长格式（即，而不是跨列重复的变量，将单元格转换为跨行重复）。此手稿中包含一个示例数据文件，以演示如何将数据文件从宽格式转换为长格式。 执行脚本中指定的混合方差分析。请注意，如果 Mauchly 的 Sphericity 测试被违反，则实施修正因子，如温室-盖瑟校正。 执行编码脚本中指定的任何必要的后量测试，以检查具有 2 个以上级别的因素之间的差异。在此示例中，执行 Bonferroni 后点位测试以比较不同类型的嵌套材料。注： 如果仅使用一个嵌套材质，则不合并主题内因子。但是，如果在多个时间点收集数据，则将这些重复度量与主体内因子的级别一样纳入其中。注：在某些情况下，野生型小鼠可能有完美的分数，因此将表现出天花板效应，导致非正态分布2。在分析数据时，请考虑适当的统计测试（例如，具有中央趋势和分散的替代度量的非参数检验）、规范化方法或稳健方法（重复度量的混合效果建模）。