포르말린 고정 조직에서 리사바이러스 항원 검출을 위한 면역조직화학 시험
Summary
여기서, 우리는 조혈 고정 조직을 위한 대체 진단 시험으로서 광견병 바이러스 항원 검출을 위한 면역조직화학 시험 프로토콜을 제시한다.
Abstract
광견병에 대한 1 차적인 진단 양식의 한은 감염된 조직 견본에 있는 바이러스성 리보뉴클레오단백질 (RNP) 복합체 (항원)의 검출입니다. 직접 형광 항체(DFA) 테스트 또는 직접적인 신속한 면역 조직화학 시험(DRIT)이 항원 검출에 가장 일반적으로 활용되지만, 두 검사 모두 항체를 사용하여 항원 검출 전에 슬라이드에 대한 노출을 위해 신선 및/또는 냉동 조직을 필요로 한다. 시료를 포름포민에서 채취및 고정하는 경우, 어느 테스트도 항원 검출에 최적이지만, 파라핀 블록 및 단면에 포함된 후 종래의 면역히토화학(IHC)에 의해 시험을 수행할 수 있다. 이 IHC 방법을 사용하면 조직은 항 광견병 항체로 염색되고, 섹션은 탈파화되고, 부분 적인 proteolysis 또는 그밖 방법에 의해 회수된 항원, 및 1 차 및 이차 항체로 배양됩니다. 항원은 고추냉이 과록시다제/아미노 에틸 카르바졸을 사용하여 염색되고 가벼운 현미경을 사용하여 시각화를 위해 헤마톡슬린으로 대응한다. 특정 항원 검출 외에도 포르말린 고정은 조직학적 변화의 결정, 표본 저장 및 운송을 위한 완화된 조건(주변 온도 미만), 회고적 사례를 테스트하는 능력 및 전염성 제의 불활성화를 통한 생물학적 안전 성 향상과 같은 다른 이점을 제공합니다.
Introduction
광견병은 속 리사바이러스1에속하는 부정적인 감각 RNA 바이러스에 의해 유발되는 급성 진행성 뇌염이다. 광견병 바이러스 (RABV)로 인한 모든 인간 사망의 거의 99 %는 개2에의해 전달됩니다. 의심되는 동물의 광견병 진단은 뇌 조직3에서게놈 RNA (리보뉴클레오 단백질 복합체, RNP)와 복합체에서 항원 (주로 바이러스 인코딩 뉴클레오 단백질, N 단백질)의 검출에 의존한다. 직접 형광 항체(DFA) 시험에 의한 항원 검출은 광견병 진단4에대한 금본위제로 간주된다. 이 방법은 신선하거나 신선한 냉동 뇌 물질, 슬라이드에 터치 인상, 아세톤에 고정, 시판되는 형광 이소티오카네이트(FITC)를 사용하여 염색하고 단클론 또는 폴리클론 항체(mAbs/pAbs)로 표시하고 형광 현미경검사법 5에의해 읽습니다. DFA 시험은 신선한 두뇌 조직에서 광견병 항원 검출을 위해 급속하고, 민감하고, 특정합니다. 최근에는 직접 신속한 면역조직화학시험(DRIT), 수정된 면역조직화학(IHC) 기술이 DFA와 유사한 민감성을 나타내고 있음을 입증했지만, 시각화를 위한 광현미경검사의 장점을6. DRIT에서 사용되는 검출 방법은 IHC와 유사하지만 초기 단계는 신선하거나 냉동된 조직을 사용하여 시료의 터치 노출을 생성한 다음 포르말린에 고정됩니다.
IHC는 파라핀 블록에 내장된 포르말린 고정 조직에서 특정 항체를 사용하여 단백질의 조직학적 변화 및 검출을 결정하는 데 널리 사용되는 기술이다. IHC는 조직 섹션7에서광견병 항원 검출을 위한 확립된 대체 시험이다. IHC는광견병8의 부담을 결정하기 위해 신경질환을 전시한 회고적 사례의 진단을 위해 특히 활용되고 있다. 파라핀-임베디드 포멀린 고정 조직은 주변 온도9에저장될 때 몇 년 후에도 검출을 위한 단백질을 보존한다. 포르말린 치료는 아미노산 측면 사슬을 교차 연결하고 변경하여 단백질을 수정하여, 이는 에피토프가 항체에 대해 더 이상 반응하지 않을 수있습니다(10). 광견병 항원 검출을 위한 IHC 시험은 mAbs 또는 pAbs를 포함하지만, 후자는 다중 에피토프및 발산 리사바이러스가11을검출할 수 있기 때문에 유리하다.
IHC에 관여하는 표준 단계는 조직의 포르말린 고정, 파라핀 블록에 포함, 조직의 단면화, 분리 및 수분 공급, 에피토프 복구, 1 차 및 이차 항체에 대한 반응성, 및 염색체 기판을 사용하여 개발. 이 원고는 광견병 진단을위한 프로토콜의 상세한 설명을 설명합니다. 광견병 항원 검출의 경우, 미국 질병통제예방센터(CDC)에서 생성된 RABV(pAbs)로 면역화된 마우스 혈청이 생물신생 항마우스 이차 항체와 함께 활용된다. 생물요닉 복근은 스트렙타비딘-고추냉이 과로시다제(HRP) 복합체의 첨가에 의해 검출되고, 아미노 에틸카르바졸 기판으로 색이 발달한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
증상 발병 후 광견병의 높은 사망률로 인해 RABV 감염에 대한 의심스러운 동물의 진단은 적절한 노출 후 예방 치료에 매우 중요합니다. 광견병 진단은 주로 신선하거나 냉동 된 조직을 사용하여 DFA, DRIT 및 PCR 기반 기술에 달려 있습니다. 포르말린 고정 조직의 테스트를 위해 IHC 검사는 RABV 항원의 민감하고 특정 검출을 위한 대체 방법을 제공합니다. 포르말린에 고정된 조직은 교차 연결같이 측사슬…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 질병 통제 및 예방 센터에 견본 제출을 위한 공중 위생 부서와 가진 실험실, 역학자 및 계열사에게 감사합니다. 이 보고서의 사실 인정 그리고 결론은 저자의 그이며 반드시 질병 통제 및 예방 센터의 공식적인 위치를 대표하지 않습니다. 무역 이름과 상업 소스의 사용은 식별을위한 것이며 질병 통제 및 예방 센터의 보증을 의미하지는 않습니다.
Materials
| 3% hydrogen peroxide | Pharamacy brands | Off the shelf 3% H2O2 | |
| 3-Amino-9-ethylcarbazole (AEC) | Millipore Sigma | A6926 | |
| Acetate Buffer pH 5.2 | Poly Scientific R&D Corp. | s140 | |
| Buffered Formalin 10% Phosphate Buffered | Fisher Scientific | SF100-4 | Certified |
| Cover slips Corning | Fisher Scientific | 12-553-471 | 24 X 50 mm |
| Ethanol 190 Proof | Pharmco-AAPER | 111000190 | |
| Ethanol 200 Proof | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Gill's hematoxylin formulation #2 | Fisher Scientific | CS401-1D | |
| HistoMark Biotin-Streptavidin Peroxidase Kit | seracare | 71-00-18 | Mouse Primary Antibody |
| ImmunoHistoMount | Millipore Sigma | i1161 | Mounting media |
| N,N, Dimethyl formamide GR | Fisher Scientific | D119 | |
| Phosphate Buffered Saline | HyClone | RR14440.01 | 01M, pH 7.2 (pH 7.2-7.6) |
| Plan-APOCHROMAT 40X/0.95 Objective | Multiple vendors | ||
| Plan-APOCHROMATIC 20X/0.75 Objective | Multiple vendors | ||
| Pronase | Millipore Sigma | 53702 | Protease, Streptomyces griseus |
| Scott's Tap Water | Poly Scientific R&D Corp. | s1887 | |
| Tissue-Tek Slide stain set | Fisher Scientific | 50-294-72 | |
| TWEEN-80 | Millipore Sigma | P1754 | |
| Xylene | Fisher Scientific | X3S-4 | Histological Grade |
| Zeiss Axioplan 2 imaging – microscope | Multiple vendors |
References
- Rupprecht, C., Kuzmin, I., Meslin, F. Lyssaviruses and rabies: current conundrums, concerns, contradictions and controversies. F1000Research. 6, 184 (2017).
- Fooks, A. R., et al. Current status of rabies and prospects for elimination. Lancet. 384 (9951), 1389-1399 (2014).
- Finke, S., Brzozka, K., Conzelmann, K. K. Tracking fluorescence-labeled rabies virus: enhanced green fluorescent protein-tagged phosphoprotein P supports virus gene expression and formation of infectious particles. Journal of Virology. 78 (22), 12333-12343 (2004).
- WHO. WHO Expert Consulation on Rabies, Third Report. WHO Technical Report Series. 1012, 1 (2018).
- Goldwasser, R. A., Kissling, R. E. Fluorescent antibody staining of street and fixed rabies virus antigens. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 98 (2), 219-223 (1958).
- Lembo, T., et al. Evaluation of a direct, rapid immunohistochemical test for rabies diagnosis. Emerging Infectious Diseases. 12 (2), 310-313 (2006).
- Fekadu, M., Greer, P. W., Chandler, F. W., Sanderlin, D. W. Use of the avidin-biotin peroxidase system to detect rabies antigen in formalin-fixed paraffin-embedded tissues. Journal of Virological Methods. 19 (2), 91-96 (1988).
- Hamir, A. N., Moser, G., Rupprecht, C. E. A five year (1985-1989) retrospective study of equine neurological diseases with special reference to rabies. Journal of Comparative Pathology. 106 (4), 411-421 (1992).
- Inoue, S., et al. Cross-reactive antigenicity of nucleoproteins of lyssaviruses recognized by a monospecific antirabies virus nucleoprotein antiserum on paraffin sections of formalin-fixed tissues. Pathology International. 53 (8), 525-533 (2003).
- Webster, J. D., Miller, M. A., Dusold, D., Ramos-Vara, J. Effects of prolonged formalin fixation on diagnostic immunohistochemistry in domestic animals. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (8), 753-761 (2009).
- Feiden, W., et al. Immunohistochemical staining of rabies virus antigen with monoclonal and polyclonal antibodies in paraffin tissue sections. Zentralblatt fur Veterinarmedizin Reihe B. 35 (4), 247-255 (1988).
- Manning, S. E., et al. Human rabies prevention–United States, 2008: recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices. Morbidity and Mortality Weekly Reports Recommendations and Reports. 57, 1-28 (2008).
- WHO. . Laboratory techniques in rabies. 1, 67-72 (2018).
- Patrick, E. M., et al. Enhanced Rabies Surveillance Using a Direct Rapid Immunohistochemical Test. Journal of Visualized Experiments. (146), (2019).
- Whitfield, S. G., et al. A comparative study of the fluorescent antibody test for rabies diagnosis in fresh and formalin-fixed brain tissue specimens. Journal of Virology Methods. 95 (1-2), 145-151 (2001).
- WHO. . Diagnostic procedures for antigen detection. , (2016).
- Jarvis, J. A., Franke, M. A., Davis, A. D. Rabies direct fluorescent antibody test does not inactivate rabies or eastern equine encephalitis viruses. Journal of Virology Methods. 234, 52-53 (2016).
