ホルマリン固定組織からのリサウイルス抗原検出のための免疫組織化学試験
Summary
ここでは、ホルマリン固定組織の代替診断試験として狂犬病ウイルス抗原の検出のための免疫組織化学試験プロトコルを紹介する。
Abstract
狂犬病の主要な診断モダリティの1つは、感染した組織サンプル中のウイルス性リボヌクレオプロテイン(RNP)複合体(抗原)の検出である。直接蛍光抗体(DFA)試験または直接迅速な免疫組織化学検査(DRIT)は、抗原検出のために最も一般的に利用されるが、両方のテストは、抗体を使用して抗原検出前のスライド上の印象のために新鮮な組織および/または凍結組織を必要とする。サンプルをホルマリンで収集して固定する場合、いずれの試験も抗原検出に最適ではないが、パラフィンブロックおよび切除に埋め込んだ後に、通常の免疫検査(IHC)によって試験を行うことができる。このIHC法により、組織は抗狂犬病抗体で染色され、切片は脱パラフィン化され、抗原は部分タンパク質分解または他の方法によって取り出され、一次および二次抗体と共にインキュベートされる。抗原は、ホサビペルオキシダーゼ/アミノエチルカルバゾールを用いて染色され、光顕微鏡を用いた可視化のためにヘマトキシリンでカウンター染色される。特異的抗原検出に加えて、ホルマリン固定は、組織学的変化の決定、標本の貯蔵および輸送のための緩和された状態(周囲温度下)、遡及症例をテストする能力、および感染性物質の不活性化による生物学的安全性の向上などの他の利点を提供する。
Introduction
狂犬病は、リサウイルス属に属するRNAウイルスの負の感覚によって引き起こされる急性進行性脳炎である。狂犬病ウイルス(RABV)による感染によって生じた全人類の死亡のほぼ99%は、属の型メンバーである、犬2によって伝染する。疑わしい動物の狂犬病診断は、脳組織3におけるゲノムRNA(リボヌクレオタンパク質複合体、RNP)と複合体中の抗原(主にウイルスコード型核タンパク質、Nタンパク質)の検出に依存する。直接蛍光抗体(DFA)検査による抗原検出は狂犬病診断4のゴールドスタンダードと考えられている。この方法は、新鮮または新鮮な凍結脳材料を利用して、スライド上のタッチ印象、アセトンでの固定、モノクローナルまたはポリクローナル抗体(mAbs/pAbs)と蛍光顕微鏡法5で読み取られる市販の蛍光イソチオシアネート(FITC)を用いて染色する。DFA試験は、新鮮な脳組織における狂犬病抗原検出に対して、迅速、感受性、および特異的である。最近、直接迅速な免疫構造化学検査(DRIT)、修飾免疫体化学(IHC)技術は、DFAと同様の感受性を示すことが実証されたが、可視化6のための光顕微鏡の利点を提供する。DRITで使用される検出方法は、IHCに似ていますが、最初のステップでは、新鮮な組織または凍結した組織を利用して、ホルマリンに固定されたサンプルのタッチインプレッションを生成します。
IHCは、パラフィンブロックに埋め込まれたホルマリン固定組織において、特定の抗体を用いて組織学的変化とタンパク質の検出を決定するために広く使用されている技術です。IHCは、組織切片7における狂犬病抗原検出のための確立された代替試験である。IHCは狂犬病の負担を決定するために神経疾患を呈した遡及症例の診断のために特に利用されてきた。パラフィン埋め込まれたホルマリン固定組織は、周囲温度9で保存した数年後でも検出のためにタンパク質を保存する。ホルマリン処理はアミノ酸側鎖を架橋および改変することによってタンパク質を修飾し、エピトープが抗体10に対して反応しなくなる可能性がある。狂犬病抗原検出のためのIHC検査にはmAbsまたはpAbsのいずれかが含まれるが、後者は複数のエピトープおよび発散性リサウイルスが11を検出できるとして有利である。
IHCに関与する標準的なステップは、組織のホルマリン固定、パラフィンブロックへの埋め込み、組織の切開、脱パラフィン化と水和、エピトープ回収、一次および二次抗体に対する反応性、および発色基質を用いた開発である。この原稿は狂犬病診断の議定書の詳細な説明を記述する。狂犬病抗原検出のために、米国疾病管理予防センター(CDC)アトランタ(ジョージア州)で発生したRABV(pAbs)で免疫されたマウス血清を、ビオチン化抗マウス二次抗体と組み合わせて利用する。ビオチン化腹筋は、ストレプトアビジン・ワサビペルオキシダーゼ(HRP)複合体の添加によって検出され、続いてアミノエチルカルバゾール基質を用いた色の発達が続く。
Protocol
Representative Results
Discussion
症状の発症後の狂犬病の死亡率が高いため、RABV感染の疑いのある動物の診断は、適切な暴露後予防治療にとって極めて重要です。狂犬病の診断は、主にDFA、DRIT、および新鮮な組織または凍結組織を使用したPCRベースの技術に依存します。ホルマリン固定組織の検査では、IHC試験はRABV抗原の敏感かつ特異的な検出のための代替方法を提供します。ホルマリンに固定された組織は、架橋のよう?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、疾病管理予防センターへのサンプル提出のために公衆衛生部門を持つ研究所、疫学者、および関連会社に感謝します。この報告書の調査結果と結論は著者のものであり、必ずしも疾病管理予防センターの公式の立場を表すものではありません。商品名と商業ソースの使用は識別のためだけであり、疾病管理予防センターによる承認を意味するものではありません。
Materials
| 3% hydrogen peroxide | Pharamacy brands | Off the shelf 3% H2O2 | |
| 3-Amino-9-ethylcarbazole (AEC) | Millipore Sigma | A6926 | |
| Acetate Buffer pH 5.2 | Poly Scientific R&D Corp. | s140 | |
| Buffered Formalin 10% Phosphate Buffered | Fisher Scientific | SF100-4 | Certified |
| Cover slips Corning | Fisher Scientific | 12-553-471 | 24 X 50 mm |
| Ethanol 190 Proof | Pharmco-AAPER | 111000190 | |
| Ethanol 200 Proof | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Gill's hematoxylin formulation #2 | Fisher Scientific | CS401-1D | |
| HistoMark Biotin-Streptavidin Peroxidase Kit | seracare | 71-00-18 | Mouse Primary Antibody |
| ImmunoHistoMount | Millipore Sigma | i1161 | Mounting media |
| N,N, Dimethyl formamide GR | Fisher Scientific | D119 | |
| Phosphate Buffered Saline | HyClone | RR14440.01 | 01M, pH 7.2 (pH 7.2-7.6) |
| Plan-APOCHROMAT 40X/0.95 Objective | Multiple vendors | ||
| Plan-APOCHROMATIC 20X/0.75 Objective | Multiple vendors | ||
| Pronase | Millipore Sigma | 53702 | Protease, Streptomyces griseus |
| Scott's Tap Water | Poly Scientific R&D Corp. | s1887 | |
| Tissue-Tek Slide stain set | Fisher Scientific | 50-294-72 | |
| TWEEN-80 | Millipore Sigma | P1754 | |
| Xylene | Fisher Scientific | X3S-4 | Histological Grade |
| Zeiss Axioplan 2 imaging – microscope | Multiple vendors |
References
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