Test d’immunohistochimie pour la détection de l’antigène du lyssavirus à partir de tissus fixés au for formel
Summary
Nous présentons ici un protocole de test d’immunohistochimie pour la détection de l’antigène du virus de la rage en tant que test de diagnostic alternatif pour les tissus fixés au for formel.
Abstract
L’une des principales modalités de diagnostic de la rage est la détection du complexe viral de ribonucléoprotéines (RNP) (antigène) dans les échantillons de tissus infectés. Bien que le test d’anticorps fluorescents directs (DFA) ou le test immunohistochimique rapide direct (DRIT) soient le plus souvent utilisés pour la détection de l’antigène, les deux tests nécessitent des tissus frais et / ou congelés pour les empreintes sur les lames avant la détection de l’antigène à l’aide d’anticorps. Si les échantillons sont prélevés et fixés dans du for formel, aucun des deux tests n’est optimal pour la détection de l’antigène, cependant, les tests peuvent être effectués par immunohistochimie conventionnelle (IHC) après intégration dans des blocs de paraffine et sectionnement. Avec cette méthode IHC, les tissus sont colorés avec des anticorps antirabiques, les sections sont déparaffinisées, l’antigène récupéré par protéolyse partielle ou d’autres méthodes, et incubé avec des anticorps primaires et secondaires. Les antigènes sont colorés à l’aide de peroxydase de raifort / carbazole d’éthyle aminé et contre-colorés avec de l’hématoxyline pour la visualisation à l’aide d’un microscope optique. En plus de la détection spécifique de l’antigène, la fixation du formoin offre d’autres avantages tels que la détermination des changements histologiques, des conditions détendues pour le stockage et le transport des échantillons (à température ambiante), la possibilité de tester des cas rétrospectifs et l’amélioration de la sécurité biologique grâce à l’inactivation d’agents infectieux.
Introduction
La rage est une encéphalite progressive aiguë causée par les virus à ARN à sens négatif appartenant au genre lyssavirus1. Près de 99% de tous les décès humains causés par l’infection par le virus de la rage (RABV), le type membre du genre, sont transmis par les chiens2. Le diagnostic de la rage chez les animaux suspects repose sur la détection d’antigènes (principalement des nucléoprotéines codées virales, protéine N) en complexe avec de l’ARN génomique (complexe ribonucléoprotéique, RNP) dans le tissu cérébral3. La détection de l’antigène par le test d’anticorps fluorescents directs (DFA) est considérée comme l’étalon-or pour le diagnostic de la rage4. La méthode utilise du matériel cérébral congelé frais ou frais, une empreinte tactile sur une lame, une fixation dans l’acétone, une coloration à l’aide d’anticorps monoclonaux ou polyclonaux marqués à l’isothiocyanate fluorescent (FITC) disponibles dans le commerce (mAbs / pAbs) et lus par la microscopie à fluorescence5. Le test DFA est rapide, sensible et spécifique à la détection de l’antigène de la rage dans les tissus cérébraux frais. Récemment, il a été démontré qu’un test immunohistochimique rapide direct (DRIT), une technique d’immunohistochimie modifiée (IHC), présentait une sensibilité similaire à celle du DFA, mais offre l’avantage de la microscopie optique pour la visualisation6. Bien que la méthode de détection utilisée dans le DRIT soit similaire à l’IHC, l’étape initiale utilise des tissus frais ou congelés pour générer des empreintes tactiles de l’échantillon, suivies d’une fixation dans du formain.
L’IHC est une technique largement utilisée pour déterminer les changements histologiques et la détection des protéines à l’aide d’anticorps spécifiques dans des tissus fixés au for formel incorporés dans des blocs de paraffine. L’IHC est un test alternatif établi pour la détection de l’antigène de la rage dans les coupes tissulaires7. L’IHC a été particulièrement utilisé pour le diagnostic des cas rétrospectifs présentant des maladies neurologiques afin de déterminer le fardeau de la rage8. Les tissus fixés au for formel incorporés dans la paraffine préservent les protéines pour la détection même après plusieurs années lorsqu’ils sont stockés à température ambiante9. Le traitement au forme modifie les protéines en réticulant et en modifiant les chaînes latérales des acides aminés, ce qui pourrait rendre les épitopes non réactifs contre les anticorps10. Alors que le test IHC pour la détection de l’antigène de la rage implique soit mAbs, soit pAbs, ce dernier est avantageux car plusieurs épitopes et lyssavirus divergents peuvent être détectés11.
Les étapes standard impliquées dans l’IHC sont la fixation des tissus par forgé, l’incorporation dans des blocs de paraffine, la section des tissus, la déparaffinisation et l’hydratation, la récupération de l’épitope, la réactivité contre les anticorps primaires et secondaires et le développement à l’aide de substrats chromogènes. Ce manuscrit décrit un compte rendu détaillé du protocole de diagnostic de la rage. Pour la détection de l’antigène de la rage, le sérum de souris immunisé avec le RABV (pAbs) généré aux Centers for Disease Control and Prevention (CDC) des États-Unis à Atlanta, en Géorgie, en combinaison avec des anticorps secondaires biotinylés anti-souris est utilisé. Les abdominaux biotinylés sont détectés par l’ajout du complexe streptavidine-peroxydase de raifort (HRP) suivi du développement de la couleur avec un substrat d’amino-éthylcarbazole.
Protocol
Representative Results
Discussion
En raison du taux élevé de mortalité de la rage après l’apparition des symptômes, le diagnostic d’animaux suspects d’infection par le RABV est extrêmement critique pour un traitement prophylactique post-exposition approprié. Le diagnostic de la rage dépend principalement des techniques basées sur le DFA, le DRIT et la PCR utilisant des tissus frais ou congelés. Pour tester les tissus fixés au for formel, le test IHC fournit une méthode alternative pour la détection sensible et spécifique de l’antig?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions les laboratoriens, les épidémiologistes et les affiliés des départements de santé publique pour les soumissions d’échantillons aux Centers for Disease Control and Prevention. Les résultats et conclusions de ce rapport sont ceux des auteurs et ne représentent pas nécessairement la position officielle des Centers for Disease Control and Prevention. L’utilisation de noms commerciaux et de sources commerciales est uniquement à des fins d’identification et n’implique pas l’approbation par les Centers for Disease Control and Prevention.
Materials
| 3% hydrogen peroxide | Pharamacy brands | Off the shelf 3% H2O2 | |
| 3-Amino-9-ethylcarbazole (AEC) | Millipore Sigma | A6926 | |
| Acetate Buffer pH 5.2 | Poly Scientific R&D Corp. | s140 | |
| Buffered Formalin 10% Phosphate Buffered | Fisher Scientific | SF100-4 | Certified |
| Cover slips Corning | Fisher Scientific | 12-553-471 | 24 X 50 mm |
| Ethanol 190 Proof | Pharmco-AAPER | 111000190 | |
| Ethanol 200 Proof | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Gill's hematoxylin formulation #2 | Fisher Scientific | CS401-1D | |
| HistoMark Biotin-Streptavidin Peroxidase Kit | seracare | 71-00-18 | Mouse Primary Antibody |
| ImmunoHistoMount | Millipore Sigma | i1161 | Mounting media |
| N,N, Dimethyl formamide GR | Fisher Scientific | D119 | |
| Phosphate Buffered Saline | HyClone | RR14440.01 | 01M, pH 7.2 (pH 7.2-7.6) |
| Plan-APOCHROMAT 40X/0.95 Objective | Multiple vendors | ||
| Plan-APOCHROMATIC 20X/0.75 Objective | Multiple vendors | ||
| Pronase | Millipore Sigma | 53702 | Protease, Streptomyces griseus |
| Scott's Tap Water | Poly Scientific R&D Corp. | s1887 | |
| Tissue-Tek Slide stain set | Fisher Scientific | 50-294-72 | |
| TWEEN-80 | Millipore Sigma | P1754 | |
| Xylene | Fisher Scientific | X3S-4 | Histological Grade |
| Zeiss Axioplan 2 imaging – microscope | Multiple vendors |
References
- Rupprecht, C., Kuzmin, I., Meslin, F. Lyssaviruses and rabies: current conundrums, concerns, contradictions and controversies. F1000Research. 6, 184 (2017).
- Fooks, A. R., et al. Current status of rabies and prospects for elimination. Lancet. 384 (9951), 1389-1399 (2014).
- Finke, S., Brzozka, K., Conzelmann, K. K. Tracking fluorescence-labeled rabies virus: enhanced green fluorescent protein-tagged phosphoprotein P supports virus gene expression and formation of infectious particles. Journal of Virology. 78 (22), 12333-12343 (2004).
- WHO. WHO Expert Consulation on Rabies, Third Report. WHO Technical Report Series. 1012, 1 (2018).
- Goldwasser, R. A., Kissling, R. E. Fluorescent antibody staining of street and fixed rabies virus antigens. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 98 (2), 219-223 (1958).
- Lembo, T., et al. Evaluation of a direct, rapid immunohistochemical test for rabies diagnosis. Emerging Infectious Diseases. 12 (2), 310-313 (2006).
- Fekadu, M., Greer, P. W., Chandler, F. W., Sanderlin, D. W. Use of the avidin-biotin peroxidase system to detect rabies antigen in formalin-fixed paraffin-embedded tissues. Journal of Virological Methods. 19 (2), 91-96 (1988).
- Hamir, A. N., Moser, G., Rupprecht, C. E. A five year (1985-1989) retrospective study of equine neurological diseases with special reference to rabies. Journal of Comparative Pathology. 106 (4), 411-421 (1992).
- Inoue, S., et al. Cross-reactive antigenicity of nucleoproteins of lyssaviruses recognized by a monospecific antirabies virus nucleoprotein antiserum on paraffin sections of formalin-fixed tissues. Pathology International. 53 (8), 525-533 (2003).
- Webster, J. D., Miller, M. A., Dusold, D., Ramos-Vara, J. Effects of prolonged formalin fixation on diagnostic immunohistochemistry in domestic animals. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (8), 753-761 (2009).
- Feiden, W., et al. Immunohistochemical staining of rabies virus antigen with monoclonal and polyclonal antibodies in paraffin tissue sections. Zentralblatt fur Veterinarmedizin Reihe B. 35 (4), 247-255 (1988).
- Manning, S. E., et al. Human rabies prevention–United States, 2008: recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices. Morbidity and Mortality Weekly Reports Recommendations and Reports. 57, 1-28 (2008).
- WHO. . Laboratory techniques in rabies. 1, 67-72 (2018).
- Patrick, E. M., et al. Enhanced Rabies Surveillance Using a Direct Rapid Immunohistochemical Test. Journal of Visualized Experiments. (146), (2019).
- Whitfield, S. G., et al. A comparative study of the fluorescent antibody test for rabies diagnosis in fresh and formalin-fixed brain tissue specimens. Journal of Virology Methods. 95 (1-2), 145-151 (2001).
- WHO. . Diagnostic procedures for antigen detection. , (2016).
- Jarvis, J. A., Franke, M. A., Davis, A. D. Rabies direct fluorescent antibody test does not inactivate rabies or eastern equine encephalitis viruses. Journal of Virology Methods. 234, 52-53 (2016).
