정상 및 헌팅턴 마우스의 급성 뇌 슬라이스에서 글루타메이트 방출 및 섭취량의 단일 시냅스 지표
Summary
우리는 성인 마우스에서 급성 조각에 단일 코르티코스트 리아 탈 글루타마티터지시냅스에서 글루타메이트 방출과 클리어런스 사이의 균형을 평가하는 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 글루타메이트 검출을 위해 형광 센서 iGluu, 신호 수집을 위한 sCMOS 카메라 및 초점 레이저 조명장치를 사용합니다.
Abstract
시냅스는 서로 독립적으로 작동하는 고도로 구획화된 기능 단위입니다. 헌팅턴병(HD) 및 기타 신경 퇴행성 질환에서 조미료 통관이 부족하고 유출 및 유출 효과로 인해 이러한 독립성이 손상될 수 있습니다. 시냅스 전 단말 및/또는 수지상 척추의 변경된 성상 세포 적 범위뿐만 아니라 글루타메이트 방출 사이트에서 글루타메이트 수송 클러스터의 감소 된 크기는 이긴장 / 과다 운동 장애의 증상을 초래하는 질병의 발병 기전에 연루되었습니다. 그러나, 헌정판에 있는 글루타마테르지시냅스의 역기능으로 이끌어 내는 기계장치는 잘 이해되지 않습니다. 시냅스 이미징을 개선하고 적용하면 움직임의 개시를 방해하는 메커니즘에 새로운 빛을 발산하는 데이터를 얻었습니다. 여기서, 우리는 새로운 유전자 부호코딩 된 초고속 글루타메이트 센서 iGluu,광시야 광학, 과학 적인 CMOS (sCMOS) 카메라, 473 nm 레이저 및 레이저 포지셔닝 시스템을 사용하여 단일 시냅스 분해능을 달성하기 위해 비교적 저렴한 접근법의 원리 요소를 설명하여 건강한 나이 또는 급성 슬라이스에서 코르티코스타탈 시냅스의 상태를 평가하였다. 글루타메이트 과도제는 활성 영역 및 ii 옆의 글루타메이트 농도[Glu]의 최대 고도에 기초하여 글루타메이트 방출의 추정치를 얻기 위해 단일 또는 다중 픽셀로부터 구성되었고, 글루아메이트 는 회음부[Glu]의 부패(TauD)의 시간 상수에 반영된 바와 같이 글루타메이트 섭취량이다. 휴식 bouton 크기와 단기 가소성의 대조 패턴의 차이는 내뇌 phalic (IT) 또는 피라미드 기관 (PT) 통로에 속하는 코르티코스테리아 말단의 식별을위한 기준으로 봉사했다. 이러한 방법을 사용하여, 우리는 증상 HD 마우스에서 ~ 40% PT 형 코르티코테리아 시냅스의 불충분 한 조미료 클리어런스를 전시 발견, 이러한 시냅스는 흥분 독성 손상에 위험이있을 수 있음을 시사. 결과는 hypokinetic 표현형을 가진 헌팅턴 마우스에 있는 역기능 시냅스의 biomarkers로 TauD의 유용성을 강조합니다.
Introduction
“단일 연결”(즉, 2개의 신경 세포 사이의 연결)에 속하는 각 시냅스 말단의 상대적 영향은 전형적으로 후진성 뉴런1,,2의초기 세그먼트에 미치는 영향에 의해 평가된다. 후성 신경세포로부터의 신체 및/또는 수지상 기록은 가장 흔한 것을 나타내며, 지금까지 가장 생산적인 수단은 하향식 또는 수직 관점 하에서 정보 처리를 명확히 하는수단3,4,,5.4 그러나, 그들의 이산성상체및(설치류에서) 중첩되지 않은 영토의 존재는 시냅스 사이트6,7,7,88,9,,10에서신호 교환, 통합 및 동기화의 국소 메커니즘에 기초한 수평 적 관점에 기여할 수 있다.
아스트로글리아가 노는 것으로 알려져 있기 때문에, 일반적으로, 퇴행성신경질환(11,,12)의 병인에 중요한 역할을 하며, 특히, 글루타마테르시냅스13,14, 15,,15,16의유지 및 가소성에 대한 역할을 하며, 다양한 표적 섬유의 공유 대상 영역에서 성상세포의 상태에 따라 시냅스 성능의 변질이 진화하는 것으로 생각된다., 건강과 질병에 있는 표적/astroglia 파생한 현지 규정 기계장치를 더 탐구하기 위하여는, 개별 적인 시냅스를 평가할 필요가 있습니다. 본 접근법은 기능성 글루타메이트 방출 및 클리어런스 지표의 범위를 추정하고 운동 개시와 가장 밀접한 관련이 있는 뇌 영역에서 기능 장애(또는 복구된) 시냅스를 식별하는 데 사용될 수 있는 기준을 정의하기 위해 노력되었다(즉, 모터 피질 및 등쪽 줄무늬에서 우선).
줄무늬는 본질적인 글루타마테르기뉴런이 부족합니다. 따라서, 엑스트라 스트리아탈 기원의 글루타마테르기성 구심을 식별하는 것은 비교적 쉽습니다. 후자는 주로 내측 시상과 대뇌 피질에서 발생합니다(17,,18,,19,,20 참조). 코르티코스타탈리탈 시냅스는 피질 층에 국한된 피라미드 뉴런의 축색에 의해 형성된다 2/3 과 5. 각각의 축삭은 섬유 계통을 통해 양측 내 말뇌파(IT) 연결 또는 동측 연결을 형성하여 피라미드 관(PT)을 더 많이 구성합니다. 또한 IT-및 PT 형 단말은 방출 특성 및 크기21,,22가다르다는 것이 더 제안되었다. 이러한 데이터를 고려할 때 글루타민산염 처리에 약간의 차이가 있을 수 있습니다.
줄무늬는 헌팅턴병(HD)에서 가장 영향을 받는 뇌영역5이다. 인간 헌 화는 심각한 유전상속 신경 퇴행성 질환이다. Q175 마우스 모델은 파킨슨병과 많은 공통점이 있는 HD의 저운동성 강성 형태의 세포 기반을 조사할 수 있는 기회를 제공합니다. 약 1년의 나이부터, 호모자이고트 Q175 마우스(HOM)는 개방된필드(23)에서운동 없이 소요된 시간을 측정함으로써 밝혀진 바와 같이 저운동증의 징후를 나타낸다. 본 실험에서 헤테로지고테 Q175 마우스(HET)를 사용하여 HOM에서 관찰된 이전 모터 적자를 확인하였고, 또한 관찰된 모터 결핍은 코르티코스테리아시냅스 말단24의바로 부근에서 성상세포성 흥분성 아미노산 수송기 2 단백질(EAAT2)의 감소된 수준을 수반하였다. 따라서 성상 성미 글루타메이트 섭취량의 적자가 각 시냅스의 기능 장애 또는 심지어 손실로 이어질 수 있다고 가설되었습니다25,,26.
여기에서, 우리는 방출된 신경 전달 물질의 양에 대하여 단 하나 시냅스 글루타메이트 정리를 평가할 수 있는 새로운 접근을 기술합니다. 새로운 글루타메이트 센서 iGluu는 코르티코스타탈 피라미드 뉴런으로 발현되었다. 카탈린터뢰크(27)에 의해 개발되었으며 이전에 도입된 높은 친화도이지만 느린 글루타메이트 센서 iGluSnFR28의변형을 나타낸다. 두 센서 모두 향상된 녹색 형광 단백질(EGFP)의 유도체입니다. 스펙트럼 및 운동 특성에 대한 경우 Helassa 등27을참조하십시오. 간단히 말해서, iGluu는 빠른 비활성화 역학을 가진 낮은 친화도 센서이므로 글루타메이트 방출 시냅스 터미널에서 글루타메이트 클리어런스를 연구하는 데 특히 적합합니다. iGluu의 해리 시간 상수는 정지-유동 장치에서 결정되었고, 이는 20°C에서 2.1 ms의 타우오프 값을 렌더링하지만, 34°C27의온도로 추정될 때 0.68 ms를 렌더링하였다. 2-광자 현미경 하에서 organotypic 해마 배양물의 CA1 영역에서 나선형 레이저 스캐닝으로 34°C에서 프로브된 단일 샤퍼 부수적 말단은 2.7 ms의 평균 시간 상수 로 나타내었다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 실험은 일반적인 관심사에 관한 것입니다 — 시냅스 독립성과 신경 변성 과정에서 의 가능한 손실, 우리는 노인 (>1 년) 마우스에서 급성 뇌 조각에 영향을받는 시냅스를 식별하는 새로운 접근 방식을 설명합니다. 최근 도입된 글루타메이트 센서 iGluu의 개선된 운동 특성을 활용하여 시냅스 글루타메이트 방출과 섭취량 사이의 관계를 이전에는 불가능했던 방식으로 조명하는 실험이 있?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 CHDI (A-12467), 독일 연구 재단 (Exc 257/1 및 DFG 프로젝트 ID 327654276 – SFB 1315) 및 샤리테의 교내 연구 기금에 의해 지원되었다. 우리는 K. Török, 세인트 조지의, 런던 대학, N. Helassa, 리버풀 대학, iGluu 플라스미드와 많은 유용한 토론에 감사드립니다. D. 베턴스와 A. 숀허르는 우수한 기술 지원을 제공했습니다.
Materials
| Stereo microsope | WPI | PZMIII | Precision Stereo Zoom Binocular Microscope |
| Stereotaxic frame | Stoelting | 51500D | Digital Lab New Standard stereotaxic frame |
| High speed drill equipment | Stoelting | 514439V | Foredom K1070 cromoter Kit |
| Injection system | Stoelting | 53311 | Quintessential Stereotaxic Injector (QSI) |
| Hamilton syringe 5 µl | Hamilton | 87930 | 75RN Syr (26s/51/2) |
| Laser positioning system | Rapp OptoElectronic | UGA-40 | UGA-40 |
| Blue laser for iGluu excitation | Rapp OptoElectronic | DL-473-020-S | 473 nm laser |
| Dichroic mirror for 473 nm | Rapp OptoElectronic | ROE TB-355-405-473 | Dichroic |
| 1P upright microscope | Carl Zeiss | 000000-1066-600 | Axioskop 2 FS Plus |
| Objective 63x/1.0 | Carl Zeiss | 421480-9900 | W Plan-Apochromat |
| 4x objective | Carl Zeiss | 44-00-20 | Achroplan 4x/0,10 |
| Dichroic mirror for iGluu | Omega optical | XF2030 | |
| Emission filter for iGluu | Omega optical | XF3086 | |
| Dichroic mirror | Omega optical | QMAX_DI580LP | |
| Emission filter for autofluorescence subtr. | Omega optical | QMAX EM600-650 | |
| sCMOS camera | Andor | ZYLA4.2PCL10 | ZYLA 4.2MP Plus |
| Acqusition software | Andor | 4.30.30034.0 | Solis |
| AD/DA converter | HEKA Elektronik | 895035 | InstruTECH LIH8+8 |
| Aquisition software | HEKA Elektronik | 895153 | TIDA5.25 |
| Electrode positioning system | Sutter Instrument | MPC-200 | Micromanipulator |
| Electrical stimulator | Charite workshops | STIM-26 | |
| Slicer | Leica | VT1200 S | Vibrotome |
| Brown/Flaming-type puller | Sutter Instr | SU-P1000 | P-1000 |
| Glass tubes for injection pipettes | WPI | 1B100F3 | |
| Glass tubes forstimulation pipettes | WPI | R100-F3 | |
| Tetrodotoxin | Abcam | ab120054 | TTX |
| iGluu plasmid | Addgene | 106122 | pCI-syn-iGluu |
| Q175 mice | Jackson Lab | 27410 | Z-Q175-KI |
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