JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
神经科学

Enkele Synapse indicatoren van glutamaat release en opname in acute hersenen plakjes van normale en Huntington muizen

Published: March 11, 2020
doi:
10.3791/60113
,
1Synaptic Dysfunction Group, Neuroscience Research Center,Charité – University Medicine

Summary

We presenteren een protocol om de balans te evalueren tussen glutamaatafgifte en klaring bij enkele corticostriatale glutamatge synapsen in acute plakjes van volwassen muizen. Dit protocol maakt gebruik van de fluorescerende sensor iGluu voor glutamaat detectie, een sCMOS camera voor signaal verwerving en een apparaat voor brandpuntslaser verlichting.

Abstract

Synapsen zijn zeer gecompartimenteerde functionele eenheden die onafhankelijk van elkaar werken. Bij de ZvH (ZvH) en andere neurodegeneratieve aandoeningen kan deze onafhankelijkheid in het gedrang komen als gevolg van onvoldoende glutamaatklaring en de daaruit voortvloeiende spill-in- en spill-out-effecten. Veranderde astrocytische dekking van de presynaptische terminals en/of dendritische stekels en een verminderde omvang glutamaattransporterclusters op glutamaatvrijgavelocaties zijn betrokken bij de pathogenese van ziekten die leiden tot symptomen van dys-/hyperkinesie. De mechanismen die leiden tot de disfunctie van glutamaterge synapsen bij de ZvH zijn echter niet goed begrepen. Verbetering en toepassing van synapsbeeldvorming hebben we gegevens verkregen die nieuw licht werpen op de mechanismen die de initiatie van bewegingen belemmeren. Hier beschrijven we de belangrijkste elementen van een relatief goedkope aanpak om enkele synapsresolutie te bereiken met behulp van de nieuwe genetisch gecodeerde ultrasnelle glutamaatsensor iGluu, wide-field optica, een wetenschappelijke CMOS (sCMOS) camera, een 473 nm laser en een laserpositioneringssysteem om de toestand van corticostriatale synapsen in acute plakjes te evalueren vanaf de leeftijd van geschikte gezonde of zieke muizen. Glutamaat transiënten werden opgebouwd uit enkele of meerdere pixels om schattingen van i) glutamaat release op basis van de maximale hoogte van de glutamaat concentratie [Glu] naast de actieve zone en ii) glutamaat opname zoals weerspiegeld in de tijd constante van verval (TauD) van de perisynaptic [Glu]. Verschillen in de grootte van de rustbouton en contrasterende patronen van plasticiteit op korte termijn dienden als criteria voor de identificatie van corticostriatale terminals als behorend tot de intratelencephalische (IT) of het piramidale kanaal (PT) pad. Met behulp van deze methoden ontdekten we dat bij symptomatische ZvH muizen ~40% van pt-type corticostriatale synapsen onvoldoende glutamaatklaring vertoonden, wat suggereert dat deze synapsen risico lopen op excitotoxische schade. De resultaten onderstrepen het nut van TauD als biomarker van disfunctionele synapsen bij ZvH muizen met een hypokintisch fenotype.

Introduction

De relatieve impact van elke synaptische terminal die behoort tot een “unitaire verbinding” (d.w.z. de verbinding tussen 2 zenuwcellen) wordt meestal beoordeeld door zijn invloed op het oorspronkelijke segment van het postsynaptische neuron1,2. Somatische en/of dendritische opnames van postsynaptische neuronen vertegenwoordigen de meest voorkomende en tot nu toe ook de meest productieve middelen om informatieverwerking te verduidelijken onder een top-down of verticaal perspectief3,4,5. De aanwezigheid van astrocyten met hun discrete en (in knaagdieren) niet-overlappende gebieden kan echter een horizontaal perspectief bieden dat is gebaseerd op lokale mechanismen van signaaluitwisseling, integratie en synchronisatie op synaptische plaatsen6,7,8,9,10.

Omdat het bekend is dat astroglia in het algemeen een belangrijke rol spelen in de pathogenese van neurodegeneratieve ziekte11,12 en, in het bijzonder, een rol in het onderhoud en de plasticiteit van glutamaterende synapsen13,14,15,16, is het denkbaar dat veranderingen in synaptische prestaties evolueren in overeenstemming met de toestand van astrocyten in het gedeelde doelgebied van afferentvezels met diverse oorsprong. Om de op het doel-/astroglia-afgeleide lokale regelgevingsmechanismen op het gebied van gezondheid en ziekte verder te onderzoeken, is het noodzakelijk om individuele synapsen te evalueren. De huidige aanpak werd uitgewerkt om het bereik van functionele glutamaatafgifte- en klaringsindicatoren te schatten en criteria te definiëren die kunnen worden gebruikt om disfunctionele (of herstelde) synapsen te identificeren in hersengebieden die het meest verband houden met bewegingsinitiatie (d.w.z. in de eerste plaats in de motorische cortex en dorsale striatum).

Het striatum mist intrinsieke glutamateren. Daarom is het relatief eenvoudig om glutamaterende afferents van extrastriatale oorsprong te identificeren. Deze laatste komen meestal voort uit de mediale thalamus en in de hersenschors (zie17,18,19,20 voor meer). Corticostriatische synapsen worden gevormd door de axonen van piramidale neuronen gelokaliseerd in corticale lagen 2/3 en 5. De respectieve axonen vormen bilaterale intra-telencephalische (IT) verbindingen of ipsilaterale verbindingen via een vezelsysteem dat meer caudally vormt de piramidale darmkanaal (PT). Voorts is gesuggereerd dat terminals van het IT- en PT-type verschillen in hun releasekenmerken en maat21,22. Gezien deze gegevens zou men ook enkele verschillen kunnen verwachten in de behandeling van glutamaat.

Het striatum is het meest aangetaste hersengebied bij de ZvH (ZvH)5. De Menselijke ZvH is een ernstige genetisch erfelijke neurodegeneratieve aandoening. Het Q175 muismodel biedt de mogelijkheid om de cellulaire basis van de hypokinetische-rigide vorm van de ZvH te onderzoeken, een toestand die veel gemeen heeft met parkinsonisme. Vanaf een leeftijd van ongeveer 1 jaar vertonen homozygote Q175 muizen (HOM) tekenen van hypokinesie, zoals blijkt uit het meten van de tijd die zonder beweging in een open veld wordt doorgebracht23. De huidige experimenten met heterozygoot Q175 muizen (HET) bevestigden de eerdere motorische tekorten waargenomen in HOM en, bovendien, bleek dat de waargenomen motortekorten gepaard gingen met een verlaagd niveau van de astrocytische excitatory aminozuur transporter 2 eiwit (EAAT2) in de onmiddellijke nabijheid van corticostriatale synaptische terminals24. Daarom is verondersteld dat een tekort aan astrocytische glutamaatopname kan leiden tot disfunctie of zelfs verlies van respectievelijk synapsen25,26.

Hier beschrijven we een nieuwe aanpak die het mogelijk maakt om enkele synapsglutamaatklaring te evalueren ten opzichte van de hoeveelheid vrijgegeven neurotransmitter. De nieuwe glutamaatsensor iGluu werd uitgedrukt in corticostriatale piramidale neuronen. Het werd ontwikkeld door Katalin Török27 en vertegenwoordigt een wijziging van de eerder geïntroduceerde hoge affiniteit, maar langzame glutamaat sensor iGluSnFR28. Beide sensoren zijn afgeleiden van het verbeterde groene fluorescerende eiwit (EGFP). Voor spectrale en kinetische kenmerken, zie Helassa et al.27. Kortom, iGluu is een low-affinity sensor met snelle de-activering kinetiek en daarom bijzonder geschikt om glutamaat klaring te bestuderen op glutamaat-vrijgevende synaptische terminals. De dissociatietijdconstante van iGluu werd bepaald in een stilstandapparaat, dat eenTau-offwaarde van 2,1 ms bij 20 °C, maar 0,68 ms maakte wanneer geëxtrapoleerd naar een temperatuur van 34 °C27. Enkele Schaffer onderpand terminals onderzocht op 34 °C met spiraallaser scanning in de CA1 regio van organotypic hippocampal culturen onder een 2-foton microscoop vertoonde een gemiddelde tijd constante van verval van 2,7 ms.

Protocol

Alle werkzaamheden zijn uitgevoerd overeenkomstig de EU-richtlijn 2010/63/EU voor dierproeven en zijn geregistreerd bij het Bureau voor gezondheidsbescherming en technische veiligheid in Berlijn (G0233/14 en G0218/17). OPMERKING: Opnames van Q175 wild-type (WT) en heterozygoten (HETs) kunnen worden uitgevoerd op elke leeftijd en geslacht. Hier bestudeerden we mannen en vrouwen op een leeftijd van 51 tot 76 weken. 1. Injectie van de Glutamaatsensor iGlu<e…

Representative Results

Identificatie van twee soorten corticostriatale glutamaterende spataderenIT- en PT-afferents komen respectievelijk voort uit laag 2/3 en 5 en vertonen differentiële vertakking- en beëindigingspatronen in het ipsilaterale en contralaterale (alleen IT-terminals) striatum. Er is nog weinig bekend over de eigenschappen van glutamaatafgifte en -klaring onder herhaalde activeringsomstandigheden, zoals waargenomen tijdens de initiatie van bewegingen, maar het is goed gedocumenteerd dat de respectieve glut…

Discussion

De experimenten hebben betrekking op een kwestie van algemeen belang — synapsonafhankelijkheid en het mogelijke verlies ervan in de loop van neurodegeneratie, en we beschrijven een nieuwe aanpak om aangetaste synapsen te identificeren in acute hersenschijfjes van oude (>1 jaar) muizen. Profiterend van de verbeterde kinetische kenmerken van de onlangs geïntroduceerde glutamaatsensor iGluu verlichten de experimenten de relatie tussen synaptische glutamaatafgifte en opname op een manier die voorheen niet mogel…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd ondersteund door CHDI (A-12467), de German Research Foundation (Exc 257/1 en DFG Project-ID 327654276 – SFB 1315) en intramurale Onderzoeksfondsen van de Charité. Wij danken K. Török, St. George’s, Universiteit van Londen, en N. Helassa, Universiteit van Liverpool, voor de iGluu plasmid en vele nuttige discussies. D. Betances en A. Schönherr zorgden voor uitstekende technische assistentie.

Materials

Stereo microsope WPI PZMIII Precision Stereo Zoom Binocular Microscope
Stereotaxic frame Stoelting 51500D Digital Lab New Standard stereotaxic frame
High speed drill equipment Stoelting 514439V Foredom K1070 cromoter Kit
Injection system Stoelting 53311 Quintessential Stereotaxic Injector (QSI)
Hamilton syringe 5 µl Hamilton 87930 75RN Syr (26s/51/2)
Laser positioning system Rapp OptoElectronic UGA-40 UGA-40
Blue laser for iGluu excitation Rapp OptoElectronic DL-473-020-S 473 nm laser
Dichroic mirror for 473 nm Rapp OptoElectronic ROE TB-355-405-473 Dichroic
1P upright microscope Carl Zeiss 000000-1066-600 Axioskop 2 FS Plus
Objective 63x/1.0 Carl Zeiss 421480-9900 W Plan-Apochromat
4x objective Carl Zeiss 44-00-20 Achroplan 4x/0,10
Dichroic mirror for iGluu Omega optical XF2030
Emission filter for iGluu Omega optical XF3086
Dichroic mirror Omega optical QMAX_DI580LP
Emission filter for autofluorescence subtr. Omega optical QMAX EM600-650
sCMOS camera Andor ZYLA4.2PCL10 ZYLA 4.2MP Plus
Acqusition software Andor 4.30.30034.0 Solis
AD/DA converter HEKA Elektronik 895035 InstruTECH LIH8+8
Aquisition software HEKA Elektronik 895153 TIDA5.25
Electrode positioning system Sutter Instrument MPC-200 Micromanipulator
Electrical stimulator Charite workshops STIM-26
Slicer Leica VT1200 S Vibrotome
Brown/Flaming-type puller Sutter Instr SU-P1000 P-1000
Glass tubes for injection pipettes WPI 1B100F3
Glass tubes forstimulation pipettes WPI R100-F3
Tetrodotoxin Abcam ab120054 TTX
iGluu plasmid Addgene 106122 pCI-syn-iGluu
Q175 mice Jackson Lab 27410 Z-Q175-KI
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Magee, J. C. Dendritic integration of excitatory synaptic input. Nature Reviews Neuroscience. 1, 181-190 (2000).
  2. Thome, C., et al. Axon-carrying dendrites convey privileged synaptic input in hippocampal neurons. Neuron. 83, 1418-1430 (2014).
  3. Larkum, M. E., Petro, L. S., Sachdev, R. N. S., Muckli, L. A Perspective on Cortical Layering and Layer-Spanning Neuronal Elements. Frontiers in Neuroanatomy. 12, 56 (2018).
  4. Spruston, N. Pyramidal neurons: dendritic structure and synaptic integration. Nature Reviews Neuroscience. 9, 206-221 (2008).
  5. Khakh, B. S., et al. Unravelling and exploiting astrocyte dysfunction in Huntington’s disease. Trends in Neurosciences. 40, 422-437 (2017).
  6. Perea, G., Navarrete, M., Araque, A. Tripartite synapses: astrocytes process and control synaptic information. Trends in Neurosciences. 32, 421-431 (2009).
  7. Perea, G., Araque, A. Astrocytes potentiate transmitter release at single hippocampal synapses. Science. 317, 1083-1086 (2007).
  8. Savtchenko, L. P., et al. Disentangling astroglial physiology with a realistic cell model in silico. Nature Communications. 9, 3554 (2018).
  9. Octeau, J. C., et al. An optical neuron-astrocyte proximity assay at synaptic distance scales. Neuron. 98, 49-66 (2018).
  10. Verkhratsky, A., Nedergaard, M. Physiology of astroglia. Physiological Reviews. 98, 239 (2018).
  11. Xie, Z., Yang, Q., Song, D., Quan, Z., Qing, H. Optogenetic manipulation of astrocytes from synapses to neuronal networks: A potential therapeutic strategy for neurodegenerative diseases. Glia. 10, (2019).
  12. Verkhratsky, A., Parpura, V., Pekna, M., Pekny, M., Sofroniew, M. Glia in the pathogenesis of neurodegenerative diseases. Biochemical Society Transactions. 42, 1291-1301 (2014).
  13. Dvorzhak, A., Melnick, I., Grantyn, R. Astrocytes and presynaptic plasticity in the striatum: Evidence and unanswered questions. Brain Research Bulletin. , 17-25 (2017).
  14. Rose, C. R., et al. Astroglial Glutamate Signaling and Uptake in the Hippocampus. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 451 (2018).
  15. Scimemi, A., Diamond, J. S. Deriving the time course of glutamate clearance with a deconvolution analysis of astrocytic transporter currents. Journal of Visualized Experiments. (10), (2013).
  16. Theodosis, D. T., Poulain, D. A., Oliet, S. H. Activity-dependent structural and functional plasticity of astrocyte-neuron interactions. Physiological Reviews. 88, 983-1008 (2008).
  17. Reiner, A., Deng, Y. P. Disrupted striatal neuron inputs and outputs in Huntington’s disease. CNS Neuroscience & Therapeutics. 24, 250-280 (2018).
  18. Plotkin, J. L., Surmeier, D. J. Corticostriatal synaptic adaptations in Huntington’s disease. Current Opinion in Neurobiology. 33, 53-62 (2015).
  19. Villalba, R. M., Smith, Y. Loss and remodeling of striatal dendritic spines in Parkinson’s disease: from homeostasis to maladaptive plasticity. Journal of Neural Transmission (Vienna). 125, 431-447 (2018).
  20. Huerta-Ocampo, I., Mena-Segovia, J., Bolam, J. P. Convergence of cortical and thalamic input to direct and indirect pathway medium spiny neurons in the striatum. Brain Structure and Function. 219, 1787-1800 (2014).
  21. Kincaid, A. E., Zheng, T., Wilson, C. J. Connectivity and convergence of single corticostriatal axons. Journal of Neuroscience. 18, 4722-4731 (1998).
  22. Reiner, A., Hart, N. M., Lei, W., Deng, Y. Corticostriatal projection neurons – dichotomous types and dichotomous functions. Frontiers in Neuroanatomy. 4, 142 (2010).
  23. Rothe, T., et al. Pathological gamma oscillations, impaired dopamine release, synapse loss and reduced dynamic range of unitary glutamatergic synaptic transmission in the striatum of hypokinetic Q175 Huntington mice. 神经科学. 311, 519-538 (2015).
  24. Dvorzhak, A., Helassa, N., Torok, K., Schmitz, D., Grantyn, R. Single synapse indicators of impaired glutamate clearance derived from fast iGluu imaging of cortical afferents in the striatum of normal and Huntington (Q175) mice. Journal of Neuroscience. 39, 3970-3982 (2019).
  25. Rebec, G. V. Corticostriatal network dysfunction in Huntington’s disease: Deficits in neural processing, glutamate transport, and ascorbate release. CNS Neuroscience & Therapeutics. 10, (2018).
  26. Friedman, A., et al. Chronic Stress Alters Striosome-Circuit Dynamics, Leading to Aberrant Decision-Making. Cell. 171, 1191-1205 (2017).
  27. Helassa, N., et al. Ultrafast glutamate sensors resolve high-frequency release at Schaffer collateral synapses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, 5594-5599 (2018).
  28. Marvin, J. S., et al. An optimized fluorescent probe for visualizing glutamate neurotransmission. Nature Methods. 10, 162-170 (2013).
  29. Paxinos, G., Franklin, K. B. J. . The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2003).
  30. Marcaggi, P., Attwell, D. Role of glial amino acid transporters in synaptic transmission and brain energetics. Glia. 47, 217-225 (2004).
  31. Bergles, D. E., Diamond, J. S., Jahr, C. E. Clearance of glutamate inside the synapse and beyond. Current Opinion in Neurobiology. 9, 293-298 (1999).
  32. Papouin, T., Dunphy, J., Tolman, M., Foley, J. C., Haydon, P. G. Astrocytic control of synaptic function. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 372, 20160154 (2017).
  33. Tzingounis, A. V., Wadiche, J. I. Glutamate transporters: confining runaway excitation by shaping synaptic transmission. Nature Reviews Neuroscience. 8, 935-947 (2007).
  34. Nedergaard, M., Verkhratsky, A. Artifact versus reality–how astrocytes contribute to synaptic events. Glia. 60, 1013-1023 (2012).
  35. Octeau, J. C., Faas, G., Mody, I., Khakh, B. S. Making, Testing, and Using Potassium Ion Selective Microelectrodes in Tissue Slices of Adult Brain. Journal of Visualized Experiments. (10), (2018).
  36. Shrivastava, A. N., Aperia, A., Melki, R., Triller, A. Physico-Pathologic Mechanisms Involved in Neurodegeneration: Misfolded Protein-Plasma Membrane Interactions. Neuron. 95, 33-50 (2017).
  37. Langfelder, P., et al. Integrated genomics and proteomics define huntingtin CAG length-dependent networks in mice. Nature Neuroscience. 19, 623-633 (2016).
  38. Pal, B. Involvement of extrasynaptic glutamate in physiological and pathophysiological changes of neuronal excitability. Cellular and Molecular Life Sciences. 75, 2917-2949 (2018).
  39. Pekny, M., et al. Astrocytes: a central element in neurological diseases. Acta Neuropathologica. 131, 323-345 (2016).
  40. Bading, H. Therapeutic targeting of the pathological triad of extrasynaptic NMDA receptor signaling in neurodegenerations. Journal of Experimental Medicine. 214, 569-578 (2017).
  41. Pajarillo, E., Rizor, A., Lee, J., Aschner, M., Lee, E. The role of astrocytic glutamate transporters GLT-1 and GLAST in neurological disorders: Potential targets for neurotherapeutics. Neuropharmacology. 10, (2019).
  42. Jensen, T. P., Zheng, K., Tyurikov, a. O., Reynolds, J. P., Rusakov, D. A. Monitoring single-synapse glutamate release and presynaptic calcium concentration in organised brain tissue. Cell Calcium. 64, 102-108 (2017).
  43. Reynolds, J. P., Zheng, K., Rusakov, D. A. Multiplexed calcium imaging of single-synapse activity and astroglial responses in the intact brain. Neuroscience Letters. 10, (2018).
  44. Kuo, H. Y., Liu, F. C. Synaptic Wiring of Corticostriatal Circuits in Basal Ganglia: Insights into the Pathogenesis of Neuropsychiatric Disorders. eNeuro. 6, 19 (2019).
  45. Untiet, V., et al. Glutamate transporter-associated anion channels adjust intracellular chloride concentrations during glial maturation. Glia. 65, 388-400 (2017).
  46. Burgold, J., et al. Cortical circuit alterations precede motor impairments in Huntington’s disease mice. Scientific Reports. 9, 6634 (2019).
  47. Jensen, T. P., et al. Multiplex imaging relates quantal glutamate release to presynaptic Ca (2+) homeostasis at multiple synapses in situ. Nature Communications. 10, 1414 (2019).
  48. Inoue, M., et al. Rational Engineering of XCaMPs, a Multicolor GECI Suite for In Vivo Imaging of Complex Brain Circuit Dynamics. Cell. 177, 1346-1360 (2019).
  49. Durst, C. D., et al. High-speed imaging of glutamate release with genetically encoded sensors. Nature Protocols. 14, 1401-1424 (2019).

Tags

Single SynapseGlutamate ReleaseGlutamate UptakeAcute Brain SlicesHuntington MiceOne-photon MicroscopeAutofluorescence CorrectionDorsal StriatumStimulation PipetteAction Potential Dependent ReleaseIon Channel BlockersMembrane ReceptorsTetrototoxin

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Dvorzhak, A., Grantyn, R. Single Synapse Indicators of Glutamate Release and Uptake in Acute Brain Slices from Normal and Huntington Mice. J. Vis. Exp. (157), e60113, doi:10.3791/60113 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image