전사 요인의 강제 표현에 의한 인간 섬유아세포의 혈생 재프로그래밍

이 프로토콜은 룬드 대학의 인간 연구 윤리위원회 지침에 따라 수행되었으며 개별 기관 지침에 따라 수행되어야합니다. 1. 시약 준비 덜베코의 수정된 독수리 배지(DMEM)/20% 태아 소 혈청(FBS)의 경우, 20% FBS, 1% 페니실린-스트렙토마이신(펜/스트렙), 1% L-글루타민, 1% 비필수 아미노산 및 10%의 필수 아미노산을함유하고 있는 고혈당 DMEM을 혼합하십시오. 메르카포에탄올. 완전한 DMEM을 원하세요, 피루베이 나트륨을 함유한 고혈당 DMEM을 10% FBS, 1% 펜/스트렙, 1% L-글루타민과 섞으세요. 조혈 매체의 경우 조혈 매체(재료 표)를10-6 M 하이드로 코르티손과 1 % 펜 / 스트렙과 섞습니다. 칼슘이나 마그네슘없이 인산염 완충식염수(PBS)를 사용하십시오. 2. 인간 진피 섬유아세포 분리 참고: HDF는 인증 된 공급 업체(재료 표)에서구입할 수 있습니다. 이 경우 섬유 아아를 확장하고 재프로그래밍 실험에 직접 사용합니다 (섹션 4). 또는, HDF는 기증자로부터 격리될 수 있다. 섬유아세포가 상이한 공여자로부터 분리되는 경우, 프로토콜의 모든 단계에서 샘플을 서로 분리된 상태로 유지한다. 각 기증자의 식별 번호가 있는 플레이트/우물 및 수집 튜브에 라벨을 붙입니다. 자격을 갖춘 의사가 수행한 3mm 라운드 피부 펀치 생검에서 HDF를 획득하십시오. 0.1% 젤라틴의 500 μL로 처리된 조직 배양 6웰 플레이트의 3개의 웰을 코팅하고 37°C에서 20분 동안 배양하였다. 나머지 젤라틴 용액을 흡인하고 각각의 우물에 750 μL의 DMEM/20% FBS를 추가합니다. 우물의 전체 표면은 매체로 덮여있어야합니다. 멸균 된 100mm 페트리 접시 뚜껑의 내부 표면에 1.5 mL의 DMEM / 20 % FBS를 추가하고 5 mL 의 혈청학적 파이펫을 사용하여 방울을 확산시다. 살균 된 집게로 뚜껑의 배지에 피부 생검을 놓습니다. 피부 생검을 9개의 동일한 섹션으로 해부하고, 한 개의 멸균된 메스를 사용하여 생검을 제자리에 고정시키고 두 번째 메스를 잘라냅니다. 뾰족한 집게를 사용하여 잘 당 3개의 생검 조각을 놓습니다. 조각이 우물의 바닥에 부착되어 있는지 확인하십시오. 조각 위에 22mm 커버 슬립을 놓고 약간의 압력을 가합니다. 플레이트를 37°C, 5%CO2에서1주일 동안 배양합니다. 매일 세포를 확인하고 증발 된 매체를 대체하기 위해 2 일마다 200 μL의 DMEM / 20 % FBS를 추가하십시오. 1주일 후, DMEM/20% FBS 의 2mL까지 추가하고 2-3일마다 배지를 교체하십시오. 우물이 수렴 될 때 1 :4 비율에서 통로 세포 (약 4-8 주). 0.1% 젤라틴 코팅 조직 배양 처리 된 6 웰 플레이트를 준비합니다. 80 % 동률에서 우물에서 배지를 흡인하고 PBS의 1 mL로 한 번 씻어. 멸균 집게로 커버슬립을 제거하고 커버슬립을 티슈 쪽을 위로 올려 놓고 6웰 플레이트의 새로운 우물에 넣습니다.참고: 커버 슬립에 부착 된 남아있는 세포도 수확됩니다. 500 μL의 해리 액을 추가(재료의 표)웰 당 (커버 립 우물 포함) 및 37 °C에서 배양, 5 %CO2 에 대한 5-10 분. 세포가 우물의 바닥에서 상승하기 시작하고 해리 솔루션을 비활성화 할 때 확인 각 우물에 500 μL의 DMEM/20% FBS를 추가합니다. 모든 우물에서 섬유아아아를 15 mL 원엽 튜브로 수집합니다. 우물에 여분의 매체를 추가하여 나머지 셀을 수집합니다. 튜브를 350 x g에서 5 분 동안 원심 분리합니다. 그 동안, 이전에 젤라틴 코팅 플레이트의 각 웰에 500 μL의 DMEM/20% FBS를 추가합니다. 흡인 배지 및 DMEM/20% FBS의 6 mL에서 섬유아세포를 재중단. 각 우물에 500 μL의 섬유아세포 현탁액을 추가합니다(총 샘플/공여자 당 6웰 플레이트 2개). 37°C, 5%CO2에서밤새 세포를 배양한다. 다음 날, 각 우물에 DMEM/20% FBS 1mL를 추가합니다. 우물이 80% 더 잘 될 때까지 매 2-3일마다 2mL의 DMEM/20% FBS로 중간을 교체하십시오. 세 번째 통로에 도달 할 때까지 세 개의 동시 우물에 대한 섹션 2.11을 반복합니다. 수렴 웰 (구절 1 및 3)에서 섬유 아세포를 동결. 우물에서 배지를 흡인하고 PBS 1 mL로 한 번 씻으하십시오. 단계 2.11.4 및 2.11.5에 기재된 바와 같이 섬유아세포를 해리하고 수집한다. 혈세포계로 세포를 카운트하고 튜브를 350 x g에서 5 분 동안 원심 분리합니다. 원심 분리 후, 배지를 흡인하고 5 x 105 세포 / mL의 밀도로 10 % DMSO로 FBS에서 섬유 아세포를 재중단합니다. 냉동 용기를 사용하여 -80°C에서 밤새 저온 및 동결 세포당 1 mL의 셀 현탁액을 추가합니다. 바이알을 -150°C(액체 질소)로 이동하여 장기간 보관하십시오. 3. 렌티바이러스 생산 HEK293T 세포를 완전한 DMEM 10 mL로 100 mm 조직 배양 처리 접시에 37°C, 5%CO2에서,합류가 될 때까지 성장시다. 형질전환 전날, 배지를 흡인하고 PBS 5 mL로 조심스럽게 접시를 씻습니다. PBS를 제거한 후, 1.5 mL의 해리액을 추가하고 37°C에서 배양하고, 5%의CO2를 5-10분 동안 배양하여 접시에서 세포를 해리한다.참고: 사용하기 전에 PBS와 해리 액을 모두 따뜻하게하여 세포가 열 충격을 받지 않도록하는 것이 좋습니다. 완전한 DMEM의 3 mL로 해리 솔루션을 비활성화하고 셀 현탁액을 15 mL 원엽 튜브로 옮김을 전달합니다. 5 mL의 완전한 DMEM으로 접시를 씻어 남은 부착 된 세포를 제거하고이 볼륨을 15 mL 원엽 튜브로 옮김하십시오. 원심분리기 세포 현탁액을 350 x g에서 5 분 동안. 흡위판 및 세포 펠릿을 접시당 10 mL의 최종 부피에서 6개의 100 mm 조직 배양 처리 된 접시 사이에 고르게 분할한다. 세포는 형질전환시 약 60%가 동률이어야 한다. 다음 날, 플라스미드와 함께 트랜스펙트 세포는 다음과 같이 혼합한다:참고: 이 프로토콜의 부분은 플라스미드 믹스당 100 mm 조직 배양 처리 된 접시에서 렌티 바이러스의 생산을 설명합니다. 농도에 대한 렌티 바이러스 상판의 더 높은 볼륨을 얻으려면, 혼합 당 적어도 4 개의 100 mm HEK293T 세포 배양 접시를 사용하십시오. 15 mL 원추형 튜브에, 함께 세 전송 플라스미드의 10 μg를 추가 : pFUW-tetO-GATA2 (아드진 플라스미드 #125028)14,3.33 μg의 pFUW-tetO-GFI1B (아제네#125597)14 및 3.33μg의 pFUW-teO-#125598 10 μg의2세대 psPAX2 패키징 벡터는 VSV-G 유전자를 인코딩하는 개그, 폴, 타트 및 레브 유전자(Addgene #12260) 및 5 μg의 pMD2.G 봉투 벡터를 인코딩(Addgene #12259). 최대 500 μL까지 물을 추가합니다. 2개의 새로운 15 mL 원추형 튜브에서 FUW-M2rtTA 플라스미드(Addgene #20342)17,psPAX2 포장 벡터 10 μg 및 각 튜브에 pMD2.G 봉투 벡터 5 μg를 추가합니다. 최대 500 μL까지 물을 추가합니다. 하나의 튜브는 대조군으로 사용될 것입니다. 각 튜브에 2 M CaCl2의62.5 μL을 추가합니다. 다음으로, 파이펫 컨트롤러에 삽입된 파스퇴르 피펫을 사용하여 각 혼합물에 기포를 방출합니다. 기포가 형성되는 동안, 피펫 500 μL의 N,N-bis(2-hydroxyethyl)-2-아미노에탄설포닉산 (BES) 완충식염수 (pH 7.1, 25 °C), P1000 파이펫, 파스퇴르 피펫에 대한 드롭 와이즈 및 혼합물에. 적어도 15 분 동안 실온에서 튜브를 인큐베이트. 혼합물은 약간의 시간이 지나면 약간 흐린 것처럼 보입니다. 한편, HEK293T 세포 접시(전날 통과)에서 배지를 흡인하고 항생제 없이 완전한 DMEM 10 mL을 첨가한다. HEK293T 세포가 반부착이기 때문에 주의하고 천천히 매체를 추가하십시오. 각 개별 혼합물(약 1 mL)을 골고루 분배하고 드롭 와이즈를 별도의 접시에 넣고 37°C, 5%CO2에서밤새 배양한다. 배지를 완전한 DMEM 4 mL로 교체하고, 배양 후 24시간 동안 교체하십시오. 37 °C, 5%CO2에서밤새 배양한다. 가능한 경우, 32°C, 5%CO2에서대신 배양하고, 감소된 온도는 렌티바이러스 입자의 반감기를 증가시킬 것이다. 50 mL 원엽 튜브에 렌티 바이러스 입자와 상류를 세 번 수집합니다. 이 시점에서 다른 렌티 바이러스 입자를 혼합하지 마십시오. 각 요리는 렌티 바이러스 상피의 12 mL귀착됩니다. 동일한 바이러스 제제의 네 가지 요리는 하나의 50 mL 원뿔 튜브에 맞습니다.주의: 렌티바이러스 작업 전용 의 생물 안전 수준-2 실험실에서 렌티바이러스 수집을 수행하고 생체 유해 물질에 적합한 용기에 바이러스 성 오염 폐기물 (튜브, 팁, 접시)을 놓습니다. 마지막 배양 후 첫 번째 컬렉션 16 h를 수행 하 고 전체 DMEM의 4 mL를 추가 합니다. 37 °C, 5 %CO2에서배양. 동일한 튜브에 제1 후 8시간 후 제2 수집을 하고, 완전한 DMEM 4 mL을 추가하고 37°C, 5%CO2에서배양한다. 세 번째 컬렉션 16 h 같은 튜브에 두 번째 후 수행 하 고 접시를 폐기.참고: 렌티바이러스 초월제를 각 수집 후 4°C에서 저장한다. 셀룰로오스 아세테이트 멤브레인(Tableof Materials)을사용하여 0.45 μm의 저단백 결합 필터를 사용하여 각 렌티바이러스 상류자를 깨끗한 튜브에 걸러. 재생된 셀룰로오스 멤브레인(재료표)이있는 원심 필터 장치에 최대 15mL의 여과 된 상구를 추가하고 4 °C에서 25 분 동안 4,000 x g에서 회전하십시오. 흐름을 통해 폐기합니다. 렌티바이러스를 함유한 점성 액체는 필터 장치에 남아 있습니다. 필터 유닛 위에 15 mL의 상판을 추가하여 3.13 단계를 반복하고, 더 이상 렌티바이러스 상류가 남지 않습니다.참고: 농축하는 상급의 몇 밀리리터가있을 때, 10 분회전 시간을 줄입니다. 필터에 여분의 액체(점도가 없는)가 있으면 원심분리기를 10분 간 추가로 사용하십시오. 농축 렌티바이러스의 각 유형의 aliquots (초기 상층 부피에 따라 50-200 μL)를 만들고 장기 보관을 위해 -80 °C (1-2 년) 또는 단기 저장 (1-2 주)에 4 °C에서 보관하십시오.참고: 농축 또는 비 농축 렌티바이러스는 또한 신선한 사용할 수 있습니다. 다시 동결 및 해동하지 마십시오 이 감소 된 티터로 결과로. 4. 혈생 리프로그래밍 참고: 3개(P3) 이상의 통로 번호가 있는 HDF를 사용하여 다시 프로그래밍 실험을 수행합니다. 100 mm 조직 배양 처리 접시를 0.1% 젤라틴 5 mL로 코팅하고 37°C에서 20분 동안 배양한다. 0.1% 젤라틴 코팅 접시에 섬유아세포 바이알 및 플레이트 세포를 해동시켰다. 37 °C, 5%CO2에서밤새 배양한다. 필요한 경우, 원하는 통과와 합류에 도달 할 때까지 더 긴 기간 동안 섬유 아아를 확장하십시오. 0.1% 젤라틴 용액의 500 μL로 6웰 조직 배양 처리 플레이트를 코팅하고 37°C에서 20분 동안 배양합니다. 플레이트 HDF는 플레이트당 150,000개의 셀(웰당 25,000셀)의 밀도로 2 mL의 웰당 완전한 DMEM을 제공합니다. 37°C, 5%CO2에서밤새 배양하여 세포 부착을 허용합니다. 중간 을 완전한 DMEM 2 mL와 8 μg / mL 폴리브렌으로 교체하십시오. 풀 생산 TF 렌티바이러스와 M2rtTA의 1:1 비율 혼합을 새로운 미세원심분리튜브에 준비한다.참고: 이 프로토콜에서는 세 개의 TF에 대한 렌티바이러스풀 생산이 수행되어 저자의 손에 더 높은 리프로그래밍 효율을 초래합니다. 대안적으로, 표준 세포주 상에서 qPCR18에의한 개별 렌티바이러스 입자의 적정을 수행하는 것이 제안된다. 이는 동시 형질전환 및 혈생 재프로그래밍에 최적 감염(MOI)의 복합성을 충족하는 데 필요한 개별 바이러스의 부피를 정의하는 데 사용됩니다. 잘 당 렌티 바이러스 혼합물의 10 ~ 100 μL을 배포, HDF를 변환합니다. 이것은 리프로그래밍의 일 -2입니다.참고: 효율적인 리프로그래밍을 위해 렌티바이러스 혼합물의 최적 부피를 정의하려면 세포 생존력을 저하시키지 않으면서 최적화가 필요합니다(자세한 내용은 추가 그림 1 참조). 7개 이상의 대구를 가진 HDF는 더 낮은 통로를 가진 세포 보다는 바이러스의 더 높은 양을 요구할 수 있습니다. 16 시간 의 배양 후 바이러스를 제거하고 완전한 DMEM을 추가하십시오. 세포가 6-8 시간 동안 회복되도록 하십시오. 회복 후 배지를 흡인하고 8 μg/ mL 폴리브렌으로 완전한 DMEM 2 mL을 추가하십시오. 단계 4.6에 기재된 바와 같이 제2 트랜스덕션을 하고 16시간 동안 37°C, 5%CO2에서 배양한다. 이것은 리프로그래밍의 날 -1입니다. 렌티바이러스 혼합물은 두 환원 모두에 대해 -2일째에 제조될 수 있고 4°C에서 유지될 수 있다. 다음 날, 바이러스를 제거하고 1 μg/mL DOX로 보충된 완전한 DMEM을 추가하십시오. 이것은 리프로그래밍의 날 0입니다. 37°C에서 배양, 5%CO2대 48시간. 리프로그래밍 의 2 일째에, 1:2 비율로 각 잘 분할. PBS의 1 mL로 배지 및 세척 세포를 흡인한다. PBS를 흡인하고 500 μL의 해리 용액으로 세포를 해리한다. 37 °C에서 5-10 분, 5 %CO2에서배양하십시오. 완전한 DMEM 의 1 mL로 해리 솔루션을 비활성화하고 원점 튜브로 세포를 수집합니다. 350 x g에서 5 분 동안 원심 분리기. 펠릿을 조혈 배지(1.3단계 참조)에 다시 중단하고, 1 μg/mL DOX로 보충하고, 플레이트 세포를 0.1% 젤라틴으로 코팅한 새로운 조직 배양 처리된 6웰 플레이트에 웰당 2 mL의 최종 부피를 보충하였다. 재프로그래밍 배양기간(25일)의 기간 동안 주 2회 배지(조혈 배지+DOX)를 변경한다. 브라이트필드 또는 형광 현미경검사법으로 서로 다른 시점에서 재프로그래밍된 세포를 분석(보충 세포분석, 대량 및 단세포 RNA 시퀀싱, 및 이식 분석법) 획득을 위한 분석 조혈 형태학, 내피 및 조혈 마커의 존재, 내피 /조혈 유전자 발현 프로필 및 재생 용량의 취득14. 5. 혈우병 재프로그래밍 의 개시시 ChIP-seq 분석을 위한 섬유아세포 확장의 최적화 플레이트 300,000 HDFs (&P8)는 0.1% 젤라틴 코팅 조직 배양 처리된 6웰 플레이트에 완전한 DMEM을 사용하여 웰당 2 mL의 최종 부피를 갖는다. 37 °C, 5%CO2에서밤새 배양한다. 다음 날, 배지를 8 μg/mL 폴리브렌으로 보충한 완전한 DMEM으로 교체하십시오. 개별 적인 요인을 가진 세포를 변환합니다: pFUW-tetO-FOS14,pLV-tetO-HA-GFI1B (addgene #125599)14 및 pFUW-tetO-3xFLAG-GATA2 (Addgene #125600)14 또는 1:1 비율의 FUW-M2rtTA를 더한 세 가지 요인의 풀. 10-20 μL 총 바이러스 (개별 TF + M2rtTA 또는 3 개의 TF + M2rtTA)를 사용하십시오. 37°C, 5%CO2에서밤새 세포를 배양한다.참고: 조건당 12개의 6웰 플레이트를 사용하는 것이 좋습니다(각 개별 TF와 3개의 TF가 결합된 경우). 렌티바이러스를 제거하고 첫 번째 전환 후 완전한 DMEM 16h를 추가합니다. 세포가 6-8 시간 동안 회복시키십시오. 조건당 동일한 양의 바이러스로 세포를 두 번째로 트랜스듀싱하고 37°C, 5%CO2에서배양한다. 다음 날에 바이러스를 제거하고 완전한 DMEM을 추가합니다. 37°C에서 배양하고, 24시간 동안 5%CO2를 배양한다. 각 웰을 0.1% 젤라틴 코팅 조직 배양-처리된 100 mm 접시에 완전한 DMEM을 접시당 최종 부피 10 mL로 재플레이트한다. 이것은 대략 1:6 구절을 나타냅니다. 세포가 37 °C, 5 %CO2에서6 일 동안 자랄 수 있게하십시오. 재도금 후 6일째에 배지를 흡인하고 1 μg/mL DOX로 완전한 DMEM을 추가합니다. 37°C에서 세포를 배양하고, 5%CO2를 2일 동안 배양한다. 섬유아세포를 수집하고 DOX 보충제14일후 ChIP-seq에 의해 개별적으로 또는 조합하여 변환된 3개의 TFs의 게놈 결합 부위를 분석한다.참고: 최종 72 개의 100mm 요리는 ChIP-seq 실험을 수행하고 복제하기에 충분한 20-50 x 106 셀을 포함합니다.