הומוגניים מתיכנות מראש של האדם פיברותקיעות על ידי ביטוי שנאכף של גורמים שעתוק

פרוטוקול זה בוצע על פי ההנחיות ועדת האתיקה של המחקר האנושי של אוניברסיטת לונד וצריך להיעשות בהתאם להנחיות מוסדיים בודדים. 1. הכנה מגיב עבור מדיום הנשר שונה של Dulbecco (DMEM)/20% סרום עוברי (FBS), לערבב הסוכר גבוהה DMEM המכילים נתרן פירובט עם 20% FBS, 1% פניצילין-סטרפטומיצין (עט/דלקת), 1% L-גלוטמין, 1%-חומצות אמינו לא חיוניות ו 10-4-M 2- רקפטואתנול. עבור dmem לאה, מערבבים הסוכר גבוה DMEM שנה המכילים נתרן פירובט עם 10% FBS, 1% עט/דלקת ו 1% L-גלוטמין. לתערובת בינונית, מערבבים בינונית (שולחן חומרים) עם 10-6 M הידרוקורטיזון ו-1% עט/דלקת. השתמש בתמיסת מלח מוזרמת פוספט (PBS) ללא סידן או מגנזיום. 2. האדם בידוד פיברובלסט הערה: ניתן לרכוש HDFs מספקים מוסמכים (טבלת חומרים). במקרה זה, להרחיב את הפיברופיצוצים ולהשתמש בהם ישירות בניסויים התכנות מתיכנות (סעיף 4). לחילופין, HDFs יכול להיות מבודד תורמים. אם הפיברופיצוצים מבודדים מתורמים שונים, השאר את הדגימות מופרדות זו מזו בכל מדרגות הפרוטוקול. לוחיות תוויות/בארות ושפופרות גבייה עם מספר הזיהוי של כל תורם. להשיג HDFs מ 3 מילימטר עור עגול אגרוף ביופסיות שבוצעו על ידי רופאים מוסמכים. מעיל שלוש בארות של התרבות רקמה מטופלת 6-צלחת עם 500 μL של 0.1% ג’לטין ו דגירה עבור 20 דקות ב 37 ° c. משלחים את הפתרון הנותר ג’לטין ולהוסיף 750 μL של DMEM/20% FBS לכל טוב. כל שטח הבאר צריך להיות מכוסה במדיום. הוסף 1.5 mL של dמאמ/20% fbs אל המשטח הפנימי של מכסה סטרילי 100 מ”מ צלחת פטרי ולהפיץ את הירידה בעזרת הצינורות 5 מ”ל סרולוגית. מניחים את הביופסיה בעור בינוני על המכסה עם מלקחיים מעוקר. לנתח את ביופסיה לעור לתשעה מקטעים זהים, באמצעות אזמל אחד מעוקר להחזיק את הביופסיה במקום אזמל שני לגזור. המקום שלושה חתיכות ביופסיה לכל טוב באמצעות מלקחיים מחודדים. ודא שהחלקים מתחברים לתחתית הבאר. הנח שמיכות 22 מ”מ על גבי החלקים ולהפעיל לחץ. מודקת את הצלחת ב 37 ° c, 5% CO2, במשך שבוע. בדוק את התאים באופן יומיומי והוסף 200 μL של DMEM/20% FBS כל 2 ימים כדי להחליף את המדיום המאדו. לאחר שבוע, יש להוסיף עד 2 מ ל של DMEM/20% FBS ולהחליף בינוני כל 2-3 ימים. תאי מעבר ביחס 1:4 כאשר הבארות משתארות (כ-4-8 שבועות). הכינו 0.1% רקמות מצופה ג’לטין התרבות שטופלו 6-היטב צלחות. מנקה בינוני מבארות ב 80% שטף ולשטוף פעם אחת עם 1 מ ל של PBS. הסר שמיכות עם מלקחיים סטרילי והמקום coverslip לתוך באר חדשה של 6-היטב צלחת, עם בצד הרקמה למעלה.הערה: תאים שנשארו מחוברים שמיכות גם יהיה לקצור. הוסף 500 μL של פתרון הדיסוציאציה (טבלת חומרים) לבאר (כולל בארות עם שמיכות) ו-דגירה ב 37 ° c, 5% CO2 עבור 5-10 דקות לבדוק כאשר התאים מתחילים לעלות מהחלק התחתון של הבאר להשבית את פתרון הדיסוציאציה על ידי הוספת 500 μL של DMEM/20% FBS לכל טוב. לאסוף את הכדורים מכל הבארות לתוך הצינור 15 מ ל חרוט. להוסיף בינוני נוסף לבארות כדי לאסוף את התאים הנותרים. צנטריפוגה את הצינור ב 350 x g עבור 5 דקות. בינתיים, להוסיף 500 μL של DMEM/20% FBS לכל היטב של צלחות בעבר מצופה ג’לטין. מנושף בינוני ומשהה את הפיברופיצוצים ב-6 מ ל/20% FBS. הוסף 500 μL של השעיית פיברובלסט לכל באר (שתי מנות 6-צלחות לכל מדגם/תורם בסך הכל). התאים הדגירה הלילה ב 37 ° c, 5% CO2. ביום שלמחרת, הוסף 1 מ ל של Dמאמ/20% FBS לכל באר. החלף בינוני עם 2 מ ל של Dמאמ/20% FBS כל 2 עד 3 ימים עד הבארות הם 80% שוטפת. חזור על סעיף 2.11 לשלוש בארות שוטפת עד למעבר השלישי. הקפאת הפיברוולים מבארות שוטפת (מעברים 1 ו -3). מנקה בינוני מבארות ושוטף פעם אחת עם 1 מ ל של PBS. הנתק ואסוף את הפיברותקיעות כמתואר בשלבים 2.11.4 ו 2.11.5. לספור תאים עם הומוציטוטומטר ו צנטריפוגה את הצינור ב 350 x g עבור 5 דקות. לאחר צנטריפוגה, משלחים בינוני ומשהה את הפיברופיצוצים ב-FBS עם 10% DMSO בצפיפות של 5 x 105 תאים/mL. הוסף 1 מ ל של השעיית התא לקריובקבוקון ולהקפיא את התאים לילה ב-80 ° c באמצעות מיכל קפוא. העבר מבחנות ל-150 ° צ’ (חנקן נוזלי) לאחסון לטווח ארוך. 3. הפקת הפקה לגדול HEK293T תאים בצלחת 100 מ”מ רקמה מטופלת עם 10 מ ל של DMEM מלאה, ב 37 ° צ’, 5% CO2, עד שליטה מגיעה. ביום שלפני החצייה, מנושף בינוני ושוטף את המנה בזהירות עם 5 מ ל של PBS. לאחר הסרת PBS, להוסיף 1.5 mL של פתרון הדיסוציאציה ו-דגירה ב 37 ° צ’, 5% CO2 עבור 5-10 דקות כדי לנתק תאים ממנה.הערה: מומלץ לחמם גם את פתרון הערוץ הPBS והדיסוציאציה לפני השימוש, כך שתאים אינם סובלים מהלם תרמי. הפעל פתרון דיסוציאציה עם 3 מ ל של DMEM מלאה ולהעביר את ההשעיה התא ל 15 מ”ל צינור חרוט. לשטוף את הצלחת עם 5 מ ל של DMEM לאה כדי להסיר את התאים המצורפים הנותרים ולהעביר את הנפח הזה ל 15 מ”ל צינור חרוט. תא צנטריפוגה מושעה ב 350 x g עבור 5 דקות. משלחים supernatant ולפצל את הגלולה תא באופן שווה בין 6 100 מ”מ רקמות רקמה מטופלים בנפח הסופי של 10 מ ל של DMEM מלא לכל מנה. התאים אמורים להיות כ-60% שוטפת בזמן ההעברה. ביום שלמחרת, תאי העברה משני התאים הפלפביניים מתערבב באופן הבא:הערה: חלק זה של הפרוטוקול מתאר את הייצור של וירוסים ב-1 100 מ”מ העור רקמה מטופלת מטופל לערבב באמצע. כדי להשיג כרכים גבוהים יותר של סופרנטאנט הרבה לריכוז, להשתמש לפחות 4 100 mm HEK293T מנות תרבות התא לכל תערובת. בתוך צינורית חרוט של 15 מ ל, להוסיף 10 μg של שלוש העברת פלסטלינה יחד: 3.33 μg של pFUW-tetO-GATA2 (הוספה גנטית פלמיד #125028)14, 3.33 μg של Pfuw-TETO-GFI1B (addgene #125597)14 ו 3.33 Μg של Pfuw-teto-מרכז (addgene #125598)14, פלוס 10 μg שלהדור 2 psPAX2 אריזה וקטור קידוד מחסום, פול, תאת והפוך גנים (addgene #12260) ו 5 μg של PMD2. G המעטפה וקטור הקידוד vsv-G (addgene #12259). הוסף מים עד 500 μL. בשני חדש 15 מ”ל צינורות חרוטי להוסיף 10 μg של FUW-M2rtTA באמצע (Addgene #20342)17, 10 Μg של psPAX2 אריזה וקטור ו 5 μg של PMD2. G מעטפה וקטור לכל צינור. הוסף מים עד 500 μL. שפופרת אחת הולכת לשמש כפקד. לכל צינור להוסיף 62.5 μL של 2 M CaCl2. הבא, לשחרר בועות לתוך כל תערובת באמצעות פסטר המחמד מוכנס לתוך בקר pipet. בעוד בועות מיוצרים, פיפטה 500 μL של n, n-bis(2-הידרולוקסיל) -2-בחומצה עמינח (בס) מלוחים באגירה (PH 7.1, 25 ° c), עם פיפטה P1000, ירידה בתבונה נגד פסטר הכומר ולתוך התערובת. מודקון צינורות בטמפרטורת החדר לפחות 15 דקות. התערובות יופיעו מעונן מעט לאחר זמן מה. בינתיים, משלחים בינוני מ HEK293T מנות תא (מעבר ליום לפני) ולהוסיף 10 מ ל של DMEM מלאה ללא אנטיביוטיקה. להיזהר ולהוסיף בינוני לאט כמו תאים HEK293T הם חצי חסיד. הפץ כל תערובת בודדת (כ 1 מ”ל) באופן שווה ושחרור לתוך מנות נפרדות ו-הדגירה לילה ב 37 ° c, 5% CO2. החלף בינוני עם 4 מ ל של DMEM מלאה, 24 שעות לאחר הדגירה. דגירה לילה ב 37 ° c, 5% CO2. אם זמין, דגירה במקום 32 ° c, 5% CO2, כמו הטמפרטורה מופחתת יגדיל את מחצית החיים של חלקיקים לנטינגיניים. לאסוף סופרנטאנט עם חלקיקים לנטינגיליים שלוש פעמים לשפופרת חרוט 50 mL. אין לערבב חלקיקים שונים בשלב זה. כל מנה תגרום ל-12 מ ל של סופרנטאנט. ארבע מנות של הכנה ויראלית זהה להשתלב לתוך צינור 1 50 mL.התראה: ביצוע איסוף ויראלי במעבדת מעבדה ברמת בטיחות ברמה 2, המוקדש לעבודה האנטי-נגיפית ולמקום פסולת נגיפית מזוהמת (צינורות, טיפים, מנות) במיכל מתאים לחומרים ביו-מסוכנים. לעשות את האוסף הראשון 16 שעות לאחר הדגירה האחרונה ולהוסיף 4 מ ל של DMEM השלם. מודטה ב 37 ° c, 5% CO2. לעשות את הקולקציה השנייה 8 h לאחר הראשון לאותו צינור, להוסיף 4 מ ל של DMEM לאה ו-דגירה ב 37 ° c, 5% CO2. לעשות את הקולקציה השלישית 16 שעות אחרי השני לאותה צינורית ולהשליך את הכלים.הערה: שומרים על הסופר-ויראלי ב -4 ° c אחרי כל אוסף. מסננים כל לעדשה supernatant באמצעות מסנן 0.45 יקרומטר חלבון נמוך עם ממברנה אצטט תאית (לוח חומרים) לצינור נקי. להוסיף מקסימום 15 מ ל של סופרנטאנט מסוננים ליחידת מסנן צנטריפוגליים עם קרום תאית מחדש (לוח חומרים) ו ספין ב 4,000 x g עבור 25 דקות, ב 4 ° c. התעלם מזרימה. נוזל צמיגי המכיל את הווירוסים יישאר ביחידת הסינון. חזור על השלב 3.13 על-ידי הוספת 15 מ ל של סופרנטנט על גבי יחידת הסינון, עד שלא יישאר עוד סופרנטנט-על.הערה: כאשר יש רק כמה מיליליטר של סופרנטאנט להתרכז, להקטין את זמן הספינינג ל 10 דקות. אם יש עדיין נוזל נוסף (לא צמיגה) על המסנן, צנטריפוגה עבור 10 דקות נוספות. הפוך את הביטוי (50 ל-200 μL בהתאם לעוצמת הקול הראשונית) של כל סוג של וירוסים מרוכזים ואחסן ב-80 ° c לאחסון לטווח ארוך (1 עד 2 שנים) או ב -4 ° c לאחסון לטווח קצר (1 עד 2 שבועות).הערה: ניתן גם להשתמש בווירוסים מרוכזים או לא מרוכזים. אין להקפיא מחדש ולהפשיר כפי שהתוצאות מופחתות. 4. תכנות מ, הומוגניים הערה: השתמש ב-HDFs עם מספר מעבר של שלושה (P3) או גבוה יותר (עד P10) כדי לבצע ניסויים שעברו תכנות מחודש. מעיל 100 מ”מ רקמות רקמה מטופלת עם 5 מ ל של 0.1% ג’לטין ו-דגירה ב 37 ° c עבור 20 דקות.. ומלא את הפתרון הנותר הפשרת בקבוקון פיברובלסט ותאי צלחת בצלחת 0.1% מצופה ג’לטין. דגירה לילה ב 37 ° c, 5% CO2. במידת הצורך, הרחיבו את הריתקיעות למשך פרק זמן ארוך יותר עד לקבלת המעבר הרצוי והשטף. מעיל 6-היטב רקמות הרקמה מטופלת עם הצלחת עם 500 μL של 0.1% הפתרון ג’לטין ו דגירה ב 37 ° c עבור 20 דקות. הסר ג’לטין נוספת. HDFs לוחית בצפיפות של 150,000 תאים לצלחת (25,000 תאים לכל טוב) ב 2 מ ל של DMEM מלא לכל טוב. מודטה לילה ב 37 ° c, 5% CO2, כדי לאפשר מצורף לתא. החלף בינוני עם 2 מ ל של DMEM מלא בתוספת 8 μg/mL polybrene. להכין שילוב 1:1 יחס של הבריכה המיוצר TF M2rtTA וירוסים ו בצינור מיקרוצנטריפוגה חדש.הערה: בפרוטוקול זה, ייצור הבריכה של הווירוסים עבור שלושת ה-TFs מבוצע, אשר, בידי המחברים, מביא ליעילות גבוהה יותר של התכנות. לחילופין, הוא הציע לבצע טיטור של חלקיקי העדשה האינדיבידואלית על ידי qPCR18, על קו תא סטנדרטי. זה ישמש כדי להגדיר את הנפח של וירוסים בודדים הדרושים כדי לענות על ריבוי של זיהום (המשרד האישי) אופטימלית עבור שיתוף התמרה ותכנות מחודש. פזר 10 עד 100 μL של תערובת ויראליות לכל טוב, כדי לשנות את HDFs. . זה היום השני של התכנות מראשהערה: הגדרת נפח אופטימלי של ערבוב ויראלי לתכנות יעיל, מבלי להתפשר על הכדאיות בתאים, מחייב אופטימיזציה (עיין באיור המשלים 1 לפרטים נוספים). HDFs עם יותר מ -7 מעברים עשויים לדרוש כמויות גבוהות יותר של וירוסים מאשר תאים עם מעברים נמוכים יותר. לאחר 16 שעות דגירה, להסיר וירוסים ולהוסיף DMEM השלם. אפשר לתאים להתאושש 6-8h. לאחר ההחלמה, משלחים בינוני ולהוסיף 2 מ ל של DMEM מלאה עם 8 μg/mL polybrene. בצע התמרה נוספת כמתואר בשלב 4.6 ו-דגירה ב 37 ° צ’, 5% CO2 עבור 16 h. . זה היום הראשון של תכנות משנה ניתן להכין את המיקס האנטי-ויראלי ביום-2 לשתי הפרשות ולשמור אותה ב -4 ° c. ביום למחרת, להסיר את הווירוסים ולהוסיף DMEM שנה מלאה עם החמצון 1 μg/mL. זהו היום הנכון. לתכנות מראש מודטה ב 37 ° c, 5% CO2 עבור 48 h. ביום 2 של תכנות משני, לפצל כל טוב ב 1:2 יחס. מנושף בינוני ושוטף תאים עם 1 מ ל של PBS. מנושף את התאים הPBS ומנתק תאי עם 500 μL של פתרון הדיסוציאציה. מודטה 5-10 דקות ב 37 ° c, 5% CO2. הפוך את פתרון הדיסוציאציה עם 1 מ ל של DMEM מלא ולאסוף תאים לתוך צינור חרוט. צנטריפוגה ב 350 x g עבור 5 דקות. השהה מחדש את הגלולה במדיום המטבית (ראה שלב 1.3), שיושלם עם 1 μg/mL חמצון, ואת התאים הצלחת לתוך רקמת רקמה חדשה התייחס 6-היטב צלחות מצופה עם 0.1% ג’לטין לנפח הסופי של 2 mL לכל טוב. שנה בינונית (בינונית בתוספת חמצון) פעמיים בשבוע למשך התרבויות התכנות משנה (25 ימים). ניתוח תאים מתוכנת מחדש וכתוצאה מכך בנקודות זמן שונות על-ידי ברייטפילד או מיקרוסקופ פלואורסצנטית (ראה המשלים איור 2), הזרמת cy, בתפזורת ו-תא יחיד ברצף RNA, ו השתלת בחני לרכישת מורפולוגיה, נוכחות של סמנים אנדותל ואת המטטיק, רכישת ביטוי גנטי בפרופיל הדלקת וקיבולת התחדשות14. 5. אופטימיזציה של הרחבת פיברובלסט לניתוח שבבים-seq בתחילת תיכנות מראש של הומוגניים לוחית 300,000 HDFs (< P8) ב 0.1% מצופה ג'לטין התרבות רקמה-מטופל 6-היטב צלחות עם DMEM להשלים את הנפח הסופי של 2 mL לכל טוב. דגירה לילה ב 37 ° c, 5% CO2. ביום שלמחרת, החלף את המדיום עם DMEM לאה בתוספת עם 8 μg/mL polybrene. תאים עם גורמים בודדים: pFUW-tetO-FOS14, plv-TETO-HA-GFI1B (dgene #125599)14 ו Pfuw-Teto-3XFLAG-GATA2 (addgene #125600)14 או עם בריכה של שלושה גורמים, בתוספת fuw-M2rtTA ביחס 1:1. השתמש בווירוס מוחלט של 10 עד 20 (בודדים TF + M2rtTA או שלושה TFs + M2rtTA). התאים הדגירה הלילה ב 37 ° c, 5% CO2.הערה: מומלץ להשתמש ב-12 לוחות הבאר לכל תנאי (עבור כל TF ושלושת ה-TFs בשילוב). הסר וירוסים מלאים והוסף D/MI מלא לאחר התמרה הראשונה. תנו לתאים להתאושש 6-8h. התאים השני בפעם השנייה עם כמות זהה של וירוס לכל תנאי ו-דגירה ב 37 ° צ’, 5% CO2. ביום הבא הסר וירוסים והוסף DMEM מלאה. מודטה ב 37 ° c, 5% CO2 עבור 24 שעות. מחדש צלחת כל טוב לתוך 0.1% מצופה ג’לטין רקמות התרבות-מטופלים 100 mm צלחת עם DMEM להשלים את הנפח הסופי של 10 מ”ל לכל מנה. הדבר מייצג מעבר 1:6 בקירוב. אפשר לתאים לצמוח במשך 6 ימים ב 37 ° c, 5% CO2. ביום 6 לאחר ציפוי מחדש, מולחים בינונית ולהוסיף DMEM לאה עם החמצון 1 μg/mL. התאים הדגירה ב 37 ° צ’, 5% CO2 עבור 2 ימים. לאסוף פיברופיצוצים ולנתח אתרים כריכה גנומית של שלושה TFs התמרה בנפרד או בשילוב, על ידי שבב-seq 2 ימים לאחר תוספת החמצון14.הערה: המנות הסופיות 72 100 mm יכילו בין 20-50 x 106 תאים, מספיק כדי לבצע ניסויים שבב-seq ושכפול.