Karakterisera enskilda protein aggregat med infraröd Nanospektroskopi och atomkraft mikroskopi

Över 40 000 000 människor i världen är för närvarande drabbade av neurodegenerativa sjukdomar, såsom Alzheimers (AD)¹ och Parkinsons (PD)² sjukdomar. Mer allmänt, mer än 50 patologier är associerade på molekylär nivå med protein neurodegenerativa och aggregation, en process som leder till spridningen av olösliga fibrillär protein aggregat, känd som amyloid insättningar^{3, 4}. den molekylära ursprunget till neurodegeneration och dess kopplingar till proteinöverensstämmande förändringar av proteiner som leder till amyloid bildas, dock fortfarande oklart, till stor del på grund av den höga graden av heterogenitet, övergående natur och nanoskala dimensionerar av de patologiska aggregaten^4,5.

Mycket framgångsrika undersökningar av proteinstrukturer under de senaste decennierna har i stor utsträckning baserats på användningen av bulkmetoder, inklusive röntgenkristallografi, kryoelektronmikroskopi och kärnmagnetisk resonans-spektroskopi^{5, 6 , 7 , 8 , 9}. inom denna klass av tekniker, infraröd (IR) spektroskopi har vuxit fram som ett känsligt analytiskt verktyg för att riva upp de kemiska egenskaperna hos biologiska system såsom proteiner⁸. IR-metoder möjliggör kvantifiering av protein sekundära och Kvartära strukturella förändringar under deras neurodegenerativa och aggregation. Dessutom, för att ytterligare dechiffrera på mikroskopisk nivå de mekanistiska detaljerna inblandade i den komplexa fria energilandskap av protein under sin aggregering, har ett stort förskott varit utvecklingen av kemisk kinetik verktyg för att utvidga till komplexa själv monterings vägar inklusive amyloid fibriller formation^{5,6,7,10,11,12}. Bulkspektroskopiska metoder ger dock endast genomsnittlig information om den heterogena ensemble av arter som finns i lösningen eller som medverkar i specifika mikroskopiska steg, vilket gör utredningen av de biofysiska egenskaperna hos enskilda aggregerad art som är utmanande på nanoskalan^13,14.

Flera mikroskopi tekniker med förmåga att driva på skalor mindre än diffraktion gränsen för ljus har uppstått under de senaste decennierna. Denna klass av metoder omfattar elektronmikroskopi (EM) och atomkraft mikroskopi (AFM). Medan scanning elektronmikroskopi (SEM) och transmissionselektronmikroskopi (TEM) ger tvådimensionella (2D) bilder av ett prov, har AFM vuxit fram under de senaste decennierna som en kraftfull och mångsidig teknik för att studera tredimensionella (3D) morfologier, som samt nanomekaniska egenskaper hos ett prov med subnanometerupplösning^{13,14,15,16,17,18,19, 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27}. logiken bakom att studera protein aggregering via AFM är att denna metod möjliggör utredning av morfologin hos enskilda arter som finns i lösning^{13,14,16, 17,19,20,21,25,27,28,29,30, 31,32,33,34,35,36,37}. I synnerhet genom att övervaka provet som en funktion av tiden, möjliggör AFM utredning av utvecklingen av morfologin hos de arter som ingår i provet, vilket gör det möjligt att följa och visualisera vägar för amyloid formation^{23, 25,38,39,40,41,42}. AFM möjliggör dessutom kvantifiering av strukturella parametrar såsom tvärsnitts höjder och längder för de enskilda arter som finns i lösning^{13,19,30,31 ,32,33,34,35,36,37,40,43, 44 , 45 , 46 , 47 , 48}studiet av en enda biofysisk egenskap, såsom morfologi, är dock ofta inte tillräckligt när man studerar heterogena och komplexa biologiska system. AFM, SEM eller TEM avbildningsmetoder ensamt inte lätt avslöja de kemiska egenskaperna hos heterogena arter av amyloid aggregat i nanoskala.

Ett stort framsteg för analysen av heterogena biologiska prover på denna skala har nyligen gjorts med utveckling och tillämpning på området för protein aggregering av infraröd nanospektroskopi (AFM-IR)^{24,26, 38,42,49,50,51,52}. Denna innovativa metod utnyttjar kombinationen av den rumsliga upplösningen av AFM (~ 1 − 10 nm) med den kemiska analys kraften hos IR. AFM-IR-tekniken baseras på mätningen av den fototermiska inducerade resonans effekten som drivs av en IR-laser, och på mätningen av den termiska expansionen av provet under utredning av AFM-spetsen. Provet kan belysas av IR-lasern direkt från toppen eller från botten i total inre reflektion, på samma sätt som i konventionell infraröd spektroskopi^24,42,52,53 . IR-lasern kan pulsas med typiska frekvenser i storleksordningen hundratals kilohertz (1 − 1000 kHz) och stämmas över ett brett spektralområde, typiskt mellan 1000 − 3300 cm^-1. Även om laserkällan täcker ett område på ~ 30 μm diameter, är den rumsliga upplösningen av AFM-IR-tekniken bestäms nominellt av AFM spets diameter, som detekterar den lokala termiska expansionen av systemet. AFM-IR lämpar sig väl för att studera biologiska prover eftersom IR-signalen är proportionell mot deras tjocklek upp till 1 − 1,5 μm, och de resulterande IR-spektra är i allmänhet överens med motsvarande FTIR transmissions Spectra^{13,54 ,55}. Av denna anledning, etablerade metoder för analys i spektroskopi kan lätt tillämpas, såsom studier av kemiska förändringar, band formförändring och de-faltning av andra derivat analys⁵². Sammantaget kombinerar den rumsliga upplösningen av AFM med den kemiska erkännande kraften i IR-spektroskopi, AFM-IR möjliggör samtidig förvärv av ett brett spektrum av morfologiska, mekaniska och kemiska egenskaper hos ett prov i nanoskala.

Här illustrerar vi ett protokoll för karakterisering av processen för protein aggregation som utnyttjar kombinationen av in vitro-fluorescensanalyser, högupplöst AFM-avbildning och nanoskala AFM-IR. Detta kombinerade tillvägagångssätt har redan utmärkt sig för att ge detaljerade resultat i att studera kemiska och strukturella egenskaper hos enskilda mikro-droppar som bildas av protein aggregat, i studien av flytande-flytande protein fasseparation, och i utreda heterogenitet och biofysiska egenskaper hos enskilda aggregerade arter i nanoskalan^{23,26,38,45,50,53, 56,57}.