אפיון מצרפים לחלבונים בודדים ע י ננו-ספקטרוסקופיה אינפרא-אדום ומיקרוסקופ כוח אטומי

מעל 40,000,000 אנשים ברחבי העולם מושפעים כיום על ידי הפרעות ניווניות, כגון אלצהיימר (AD)¹ ו פרקינסון (PD)² מחלות. באופן כללי יותר, יותר מ-50 הפתווגיות משויכים ברמה המולקולרית עם misfolding חלבון ומצבור, תהליך המוביל התפשטות של אגרגטים מסיסים חלבון fibrillar, המכונה פיקדונות עמילואיד^{3, 4}. המקורות המולקולריים של ניוון שולי והקשרים שלה עם חלבון התאמות שינויים של חלבונים המובילים היווצרות עמילואיד, עם זאת, נשאר ברור, בחלק גדול בגלל הרמה הגבוהה של טרוגניות, הטבע ארעי ו ננו-סקאלה מידות האגרגטים הפתולוגיים^4,5.

חקירות מוצלחות ביותר של מבני חלבונים בעשורים האחרונים התבססו באופן נרחב על שימוש בשיטות בצובר, כולל קריסטלוגרפיה בקרני רנטגן, מיקרוסקופ הקפאה אלקטרוני וספקטרוסקופיית תהודה מגנטית גרעינית^5, מיכל בן ^{6 ,} מיכל ^{סבן ,} בן ^{שמונה , 9}. בתוך מחלקה זו של טכניקות, אינפרא אדום (IR) ספקטרוסקופיית התפתחה ככלי אנליטי רגיש כדי לפענח את המאפיינים הכימיים של מערכות ביולוגיות כגון חלבונים⁸. שיטות IR מאפשרות את כימות החלבון של שינויים מבניים משני החלבונים במהלך הקיפול והצבירה שלהם. בנוסף, על מנת לפענח ברמה המיקרוסקופית את הפרטים המכניים המעורבים בנופי האנרגיה המסובכים של החלבון במהלך הצבירה שלהם, מקדמה גדולה הייתה פיתוח כלים קינטיקה כימית להרחבת מורכבות הרכבה עצמית מסלולים כולל עמילואיד סיבים היווצרות^{5,6,7,10,11,12}. עם זאת, שיטות ספקטרוסקופיות בצובר מספקות מידע ממוצע בלבד על ההרכב הטרוגנית של מינים המצויים בפתרון או מעורב בצעדים מיקרוסקופיים מסוימים, ובכך מציג את החקירה של המאפיינים הביופיסיים של הפרט מינים צבורים מאתגרים ברמת ננו^13,14.

בעשורים האחרונים הופיעו מספר טכניקות מיקרוסקופ עם יכולת הפעלה על קשקשים קטנים יותר מאשר מגבלת האור העקיפה. מחלקה זו של שיטות כוללת מיקרוסקופ אלקטרוני (EM) ומיקרוסקופ כוח אטומי (AFM). בעוד סריקת אלקטרון מיקרוסקופ (SEM) ומיקרוסקופ אלקטרון הילוכים (TEM) לספק דו מימדי (2D) תמונות של הדגימה, AFM התפתחה בעשורים האחרונים כטכניקה רבת עוצמה ורב תכליתי ללמוד תלת מימדי (3D) מורפולוגיות, כמו וכמו כן המאפיינים הננו של מדגם עם רזולוציה של תת-נאנמטר^{13,14,15,16,17,18,19,} מיכל בן ^{20 ,} מיכל ^{בן 21 ,} מיכל בן ^{22 ,} מיכל בן ^{23 ,} בת ^{24 ,} מיכל בן ^{25 ,} מיכל בן ^{26 , 27}. הרציונל מאחורי לימוד צבירת חלבונים באמצעות afm הוא שגישה זו מאפשרת את חקירת המבנה של מינים בודדים המצויים בתמיסה^{13,14,16, 17,19,20,21,25,27,28,29,30, 31,32,33,34,35,36,37}. במיוחד, על ידי ניטור המדגם כפונקציה של זמן, AFM מאפשר את חקירת האבולוציה של המבנה של המינים בתוך המדגם, מה שמאפשר לעקוב ולדמיין את המסלולים של היווצרות עמילואיד^{23, 25,38,39,40,41,42}. יתרה מזאת, afm מאפשר כימות של פרמטרים מבניים כגון הגבהים הצולבים ואורכים של המינים הבודדים נוכח פתרון^{13,19,30,31 ,32,33,34,35,36,37,40,43, 44 , 45 , 46 , 47 , 48}. עם זאת, המחקר של נכס ביופיזיקלי יחיד, כגון מורפולוגיה, הוא לעתים קרובות לא מספיק בעת לימוד הטרוגנית מערכות ביולוגיות מורכבות. AFM, SEM או שיטות הדמיה בלבד לא לחשוף בקלות את התכונות הכימיות של מינים הטרוגנית של אגרגטים עמילואיד בסולם הננו.

מראש מרכזי לניתוח של דגימות ביולוגיות הטרוגנית בקנה מידה זה נעשה לאחרונה עם פיתוח ויישום לתחום של צבירת חלבון של ננוספקטרוסקופיה אינפרא אדום (afm-IR)^{24,26, 38,42,49,50,51,52}. שיטה חדשנית זו מנצלת את השילוב של הרזולוציה המרחבית של AFM (~ 1-10 ננומטר) עם כוח הניתוח הכימי של IR. טכניקת AFM-IR מתבססת על מדידת אפקט התהודה של פוטותרמי שמונעת על ידי לייזר IR, ועל מדידת ההתרחבות התרמית של המדגם בחקירה באמצעות העצה AFM. המדגם יכול להיות מואר על ידי לייזר IR ישירות מהחלק העליון או מהחלק התחתון של השתקפות פנימית מוחלטת, בדומה כמו באמצעות ספקטרוסקופיית אינפרא אדום קונבנציונאלי^24,42,52,53 . לייזר IR יכול להיות פעמו עם תדרים טיפוסיים בסדר של מאות קילוהרץ (1-1000 kHz) ומכוונים על טווח ספקטרלי רחב, בדרך כלל בין 1000-3300 ס מ^-1. למרות שמקור הלייזר משתרע על שטח של בקוטר של ~ 30 יקרומטר, הרזולוציה המרחבית של טכניקת afm-IR נקבעת בהתאם לקוטר קצה afm, המזהה את התרחבות התרמית המקומית של המערכת. Afm-IR מתאים היטב לחקר דגימות ביולוגיות מכיוון שהאות האינפרא-אדום פרופורציונלי לעובי שלהם עד 1-1.5 μm, והספקטרום של האינפרא-אדום המתקבל בדרך כלל בהסכמה עם ספקטרום התמסורת התואם של ftir^{13,54 ,55}. מסיבה זו, שיטות מבוססות ניתוח בספקטרוסקופיה ניתן להחיל בקלות, כגון המחקר של שינויים כימיים, צורת הלהקה שינוי ו-de-קונבולוציה על ידי הנגזרות השני ניתוח⁵². בסך הכל, שילוב הרזולוציה המרחבית של AFM עם כוח הזיהוי הכימי של ספקטרוסקופיית IR, AFM-IR מאפשר רכישה בו של מגוון רחב של תכונות מורפולוגיות, מכניות וכימיות של מדגם בסולם הננו.

כאן, אנו ממחישים פרוטוקול לאפיון התהליך של צבירת חלבונים המנצלת את השילוב של הקרינה הפלואורסצנטית מתורבת, ברזולוציה גבוהה AFM הדמיה וננו AFM-IR. גישה משולבת זו כבר הצטיין במתן תוצאות מפורטות לימוד תכונות כימיות ומבניות של מיקרו-טיפות בודדות שנוצרו על ידי אגרגטים חלבונים, במחקר של הפרדה נוזל נוזלי בשלב החלבון, וב חקירת המאפיינים טרוגניות וביופיזיים של מינים צבורים בודדים ב-ננוסקאלה^{23,26,38,45,50,53, 56,57}.