成体ゼブラフィッシュテレンスファロンにおけるプラスミドDNAの生体内送達に関するエレクトロポレーション法

ゼブラフィッシュは、刺し傷の損傷後の脳再生を調べる優れた動物モデルです。哺乳類と比較して、進化のはしごでは、ゼブラフィッシュのようなあまり進化した種は、一般的に構成的神経新生の高い率と成体神経幹細胞滞留のより広い領域を示し、全体で新しいニューロンの一定の生成につながります成人生活のほとんどの脳領域。この特徴は、ゼブラフィッシュが研究されたほとんどの脳損傷モデルで新しいニューロンを効率的に生成する顕著な可能性を有するように、哺^乳類1と比較してゼブラフィッシュの著しく高い再生能力と相関しているように見^{える2、 3,4,5,6,7,8}.ここでは、成人期に顕著な神経新生を有する脳領域であるため、ゼブラフィッシュテレンスファロンが研究される。成人神経新生のこれらのゾーンは、成人哺乳動物^{脳9、10、11}における神経原ゾーンに相同である。

ゼブラフィッシュテレスファロン中の豊富な神経原領域は、細胞またはエペンディモリア細胞のような放射状グリアの存在に起因する。エペンディモグリア細胞は、常駐成人神経幹細胞として機能し、無傷および再生^脳3、5の両方で新しいニューロンの生成を担当しています。系統トレース実験は、心室のエペンディモリアが傷害に反応し、増殖し、病変部^位5に移行する新しい神経芽細胞を生成することを示している。ゼブラフィッシュテレスファロンの絶え間ない性質のために、エペンディモグリア細胞は心室表面に並び、心室壁を構築する。後部心室壁は、後頭形前形細胞層によって形成される(図1A)。重要なことに、ゼブラフィッシュエペンディモリアは、哺乳類の放射状グリアおよびエペンディマル細胞の両方の特性を具体化する。長い放射状プロセスは、放射状グリア細胞の典型的な特徴であるのに対し、細胞拡張およびタイトジャンクション(ならびにその心室位置)は、エペンディマル細胞12、13、14の典型的な特徴である。したがって、これらの細胞は、エペンディモグリア細胞と呼ばれる。

再生中の単一のエペンディモグリア細胞の生体内挙動に従うには、確実に標識する必要があります。蛍光顕微鏡検査用の生体内細胞標識における種々の方法は、内因性レポーターまたは親油性染^料15など、以前に記載されている。これらの方法は、エレクトロポレーションとは対照的に、より長い期間の時間を必要とし、多くの場合、単一細胞標識または永久的な長期トレースの可能性を提供しない。しかし、エレクトロポレーションは(単一細胞標識の他に)、宿主細胞に新しいDNAを導入する可能性を提供する。また、細胞へのDNA移植の他の方法と比較して、エレクトロポレーションは、最も効率的な方法の一つであることが実証されている16、17、18、19。

ここで提示されるエレクトロポレーションプロトコルは、成体ゼブラフィッシュテレンセファロン中の単一のエペンディモグリア細胞を標識する目的で精製された。このプロトコルは、長期^期間20にわたってそれらに従うか、または細胞自律的な方法で特定の経路を操作するために、単一のエペンディモグリア細胞の標識を可能に^{する21,22。}