Metodo di elettroporazione per in vivo Consegna del DNA plasmide nel Telencephalon del pesce zebra adulto

I pesci zebra sono eccellenti modelli animali per esaminare la rigenerazione cerebrale dopo una lesione da taglio. Rispetto ai mammiferi, sulla scala evolutiva, le specie meno evolute come il pesce zebra mostrano generalmente tassi più elevati di neurogenesi costitutiva e aree più ampie di residenza delle cellule staminali neurali adulte, portando a una generazione costante di nuovi neuroni in tutto la maggior parte delle aree cerebrali nella vita adulta. Questa caratteristica sembra correlare con una capacità rigenerativa significativamente più elevata del pesce zebra rispetto ai mammiferi¹, poiché i pesci zebra hanno un notevole potenziale per generare in modo efficiente nuovi neuroni nella maggior parte dei modelli di lesioni cerebrali studiati^{2, 3,4,5,6,7,8}. Qui, il telecefalo del pesce zebra è studiato, poiché è una zona del cervello con neurogenesi prominente in età adulta. Queste zone di neurogenesi adulta sono omologhe alle zone neurogeniche nel cervello dei mammiferi adulti^9,10,11.

Abbondanti aree neurogeniche nel telencephalon del pesce zebra sono presenti a causa dell’esistenza di glia radiali come cellule o cellule ependymoglia. Le cellule ependymogliali agiscono come cellule staminali neurali adulte residenti e sono responsabili della generazione di nuovi neuroni sia nel cervello intatto che in quello rigenerante^3,5. Esperimenti di tracciamento del lignaggio hanno dimostrato che l’ependymoglia ventricolare reagisce alle lesioni, quindi prolifera e genera nuovi neuroblasti che migrano al sito di lesione⁵. A causa della natura eversadela del telecefalo del pesce zebra, le cellule ependymogliali allineano la superficie ventricolare e costruiscono la parete ventricolare ventrale. La parete ventricolare dorsale è formata da uno strato di cellule ependymal dorsale (Figura 1A). È importante sottolineare che il pesce zebra ependymoglia incarna le caratteristiche della glia radiale dei mammiferi e delle cellule ependymal. I lunghi processi radiali sono una caratteristica tipica delle celle radiali glia, mentre le estensioni cellulari e le giunzioni strette (così come le loro posizioni ventricolari) sono caratteristiche tipiche delle cellule ependymal^12,13,14. Pertanto, queste cellule sono indicate come cellule ependymoglial.

Per seguire il comportamento in vivo delle singole cellule ependymoglial durante la rigenerazione, devono essere etichettate in modo affidabile. Sono stati descritti in precedenza vari metodi di etichettatura cellulare in vivo per la microscopia fluorescente, come i giornalisti endogeni o i coloranti lipofili¹⁵. Questi metodi, a differenza dell’elettroporazione, possono richiedere periodi di tempo più lunghi e spesso non offrono la possibilità di etichettatura a cella singola o di tracciamento permanente a lungo termine. L’elettroporazione, tuttavia (oltre all’etichettatura a singola cellula), offre la possibilità di introdurre nuovo DNA nella cellula ospite. Inoltre, rispetto ad altri metodi di trasferimento del DNA nelle cellule, l’elettroporazione è stata dimostrata essere uno dei metodi più efficienti^16,17,18,19.

Presentato qui è un protocollo di elettroporazione che è stato perfezionato allo scopo di etichettare singole cellule ependymoglial nel telecefalo di zebra per adulti. Questo protocollo consente l’etichettatura di singole cellule ependymoglial per seguirle per un periodo²⁰ a lungo termine o per manipolare percorsi specifici in modo cellulare-autonomo^21,22.