Summary

Elektroporationsmethode zur In-Vivo-Lieferung von Plasmid-DNA im erwachsenen Zebrafisch Telencephalon

Published: September 13, 2019
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Summary

Präsentiert wird hier eine Elektroporationsmethode für die Plasmid-DNA-Abgabe und ependymogliale Zellbeschriftung im erwachsenen Zebrafischtelencephalon. Dieses Protokoll ist eine schnelle und effiziente Methode zur Visualisierung und Verfolgung einzelner ependymoglialer Zellen und eröffnet neue Möglichkeiten, Elektroporation auf eine breite Palette genetischer Manipulationen anzuwenden.

Abstract

Elektroporation ist ein Transfektionsverfahren, bei dem ein elektrisches Feld auf Zellen angewendet wird, um temporäre Poren in einer Zellmembran zu erzeugen und ihre Durchlässigkeit zu erhöhen, wodurch verschiedene Moleküle in die Zelle eingeführt werden können. In diesem Papier wird Elektroporation verwendet, um Plasmide in ependymogliale Zellen einzuführen, die die ventrikuläre Zone des erwachsenen Zebrafischtelencephalons aussäumen. Ein Bruchteil dieser Zellen zeigt Stammzelleigenschaften und erzeugt neue Neuronen im Zebrafischgehirn; Daher ist es wichtig, ihr Verhalten zu untersuchen, um ihre Rolle bei der Neurogenese und Regeneration zu bestimmen. Die Einführung von Plasmiden über Elektroporation ermöglicht die langfristige Kennzeichnung und Verfolgung einer einzelnen ependymogliaalen Zelle. Darüber hinaus können Plasmide wie Cre recombinase oder Cas9 an einzelne ependymogliade Zellen abgegeben werden, was eine Genrekombination oder Genbearbeitung ermöglicht und eine einzigartige Gelegenheit bietet, die autonome Genfunktion der Zelle in einer kontrollierten, natürlichen umgebung. Schließlich wird dieses detaillierte, schrittweise Elektroporationsprotokoll verwendet, um eine erfolgreiche Einführung von Plasmiden in eine große Anzahl von einzelnen ependymogliaalen Zellen zu erhalten.

Introduction

Zebrafische sind ausgezeichnete Tiermodelle, um die Hirnregeneration nach einer Stichwunde zu untersuchen. Im Vergleich zu Säugetieren weisen auf der evolutionären Leiter weniger entwickelte Arten wie Zebrafische im Allgemeinen höhere Raten konstitutiver Neurogenese und breitere Bereiche des aufenthaltes von adulten neuronalen Stammzellen auf, was zu einer konstanten Erzeugung neuer Neuronen im gesamten die meisten Hirnbereiche im Erwachsenenleben. Diese Funktion scheint mit deutlich höheren Regenerationsfähigkeit von Zebrafischen im Vergleich zu Säugetieren1korrelieren, da Zebrafische ein bemerkenswertes Potenzial haben, in den meisten untersuchten Hirnverletzungsmodellen effizient neue Neuronen zu erzeugen2, 3,4,5,6,7,8. Hier wird der Zebrafisch Telencephalon untersucht, da es sich um ein Hirngebiet mit prominenter Neurogenese im Erwachsenenalter handelt. Diese Zonen der adulten Neurogenese sind homologe zu neurogenen Zonen im erwachsenen Säugetiergehirn9,10,11.

Reichlich neurogene Bereiche im Zebrafisch Telencephalon sind aufgrund der Existenz von radialen Glia wie Zellen oder Ependymoglia-Zellen vorhanden. Ependymogliade Zellen fungieren als ansässige adulte neuronale Stammzellen und sind verantwortlich für die Erzeugung neuer Neuronen sowohl im intakten als auch im regenerierenden Gehirn3,5. Lineage-Tracing-Experimente haben gezeigt, dass ventrikuläre Ependymoglia auf Verletzungen reagieren, sich dannvermehren und neue Neuroblasten erzeugen, die zur Läsionsstelle 5 wandern. Aufgrund der immerleten Natur von Zebrafischtelencephalon säumen ependymogliale Zellen die ventrikuläre Oberfläche und bauen die ventrale ventrikuläre Wand. Die dorsale ventrikuläre Wand wird durch eine dorsale ependymale Zellschicht gebildet (Abbildung 1A). Wichtig ist, dass Zebrafische ependymoglia die Eigenschaften sowohl der Radialglia als auch der ependymalen Zellen verkörpern. Lange radiale Prozesse sind ein typisches Merkmal von radialen Gliazellen, während Zellverlängerungen und enge Knoten (sowie ihre ventrikulären Positionen) typische Merkmale der ependymalen Zellen12,13,14sind. Daher werden diese Zellen als ependymogliade Zellen bezeichnet.

Um dem In-vivo-Verhalten einzelner ependymotgliaaler Zellen während der Regeneration zu folgen, müssen sie zuverlässig beschriftet werden. Verschiedene Methoden der In-vivo-Zellbeschriftung für die fluoreszierende Mikroskopie wurden bereits beschrieben, wie z. B. endogene Reporter oder lipophile Farbstoffe15. Diese Methoden können im Gegensatz zur Elektroporation längere Zeiträume erfordern und bieten oft nicht die Möglichkeit der Einzelzellkennzeichnung oder permanenten Langzeitverfolgung. Die Elektroporation bietet jedoch (neben der Einzelzellbeschriftung) die Möglichkeit, neue DNA in die Wirtszelle einzuführen. Darüber hinaus hat sich im Vergleich zu anderen Methoden der DNA-Übertragung in die Zellen gezeigt, dass die Elektroporation eine der effizientesten Methoden16,17,18,19ist.

Hier wird ein Elektroporationsprotokoll vorgestellt, das verfeinert wurde, um einzelne ependymogliale Zellen im erwachsenen Zebrafischtelencephalon zu kennzeichnen. Dieses Protokoll ermöglicht die Kennzeichnung einzelner ependyglialer Zellen, um ihnen über einen längeren Zeitraumvon 20 zu folgen oder bestimmte Wege zellautonom zu manipulieren21,22.

Protocol

Alle in diesem Protokoll verwendeten Tiere wurden unter Standardhaltungsbedingungen gehalten, und die Versuche wurden gemäß den Handhabungsrichtlinien und -vorschriften der EU und der Regierung von Oberbayern durchgeführt (AZ 55.2-1-54-2532-0916). 1. Herstellung von Plasmidmischung zur Elektroporation Verdünnen Sie das Plasmid von Interesse an sterilem Wasser und fügen Sie schnelle grüne Fleckenstammlösung [1 mg/ml] hinzu. Stellen Sie sicher, dass die Endkonzentration des Plas…

Representative Results

Die beschriebene Elektroporationsmethode ermöglicht die Abgabe von Plasmid-DNA in ependymogliale Zellen, die sich oberflächlich im Zebrafischtelencephalon und knapp unter der dorsalen ependymalen Zellschicht befinden (Abbildung 1A). Wenn das Ergebnis der Elektroporation positiv ist, können markierte einzelne ependygliale Zellen (rote Zellen in Abbildung 2A,B) unter anderen ependy…

Discussion

Dieses Elektroporationsprotokoll ist eine zuverlässige In-vivo-Methode zur Kennzeichnung einzelner ependymotaler Zellen. Das Protokoll kann eine weitere Anpassung benötigen, um andere Zelltypen wie Neuronen oder Oligodendrozyten zu kennzeichnen. Um eine erfolgreiche Kennzeichnung zu erreichen, können Plasmide verwendet werden, die verschiedene Promotoren enthalten. Chicken-beta Actin Promoter, eF1alpha, CMV und Ubiquitin Promoter wurden zuvor verwendet, um die Expression von verschiedenen Transgenen in Ependymoglia un…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Besonderer Dank geht an James Copti für die Bearbeitung des Manuskripts. Wir danken auch der Finanzierung von JN durch die Deutsche Forschungsstiftung (DFG) durch die SFB 870 und SPP “Integrative Analyse der Olfaction” und SPP 1738 “Emerging roles of non-coding RNAs in nervous system development, plastizität & disease”, SPP1757 ” Glial heterogenity” und Exzellenzstrategie im Rahmen des Munich Cluster for Systems Neurology (EXC 2145 SyNergy – ID 390857198).

Materials

Reagent/Material
Fast Green Sigma-Aldrich F7258-25G For coloring plasmid solution
MS222 Sigma-Aldrich A5040-25G MS222 should be stored at RT (up to two weeks) and protected from light
Ultrasound gel SignaGel, Parker laboratories INC. 15-60 Electrode Gel
Equipment
Air pump TetraTec APS 50, 10l-60l Can be bought in the pet shops
BTX Tweezertrodes Electrodes Platinum Tweezertrode, BTX Harvard Apparatus 45-0486 1mm diameter
Electroporation device BTX ECM830 Square Wave Electroporation System, BTX Harvard Apparatus 45-0662
Injection device FemtoJet 4i, Eppendorf 5252000013
Standard Wall Borosillicate Glass Capillary Warner Instruments 64-0766 Model No: G100-4
Microloader tips Eppendorf 5242956003
Micro-knife Fine Science Tools 10056-12
Joystick micromanipulator Narishige Japan MN – 151
Needle holder FemtoJet 4i, Eppendorf 5252000013 Needle holder comes together with the injection device
Needle pulling device Narishige Japan Model No: PC-10 The PC-10 was discontinued by Narishige in 2017 and replaced by the PC-100
Petri dishes Greiner Bio-One International 633161

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Durovic, T., Ninkovic, J. Electroporation Method for In Vivo Delivery of Plasmid DNA in the Adult Zebrafish Telencephalon. J. Vis. Exp. (151), e60066, doi:10.3791/60066 (2019).

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