הערכה לפירעון ביצת אנוש ויישומו הקליני
Summary
אנו מספקים מיתאר של הפרוטוקול הקליני להערכת לא פולשנית של בגרות ביצה אנושית באמצעות מיקרוסקופ אור מקוטב.
Abstract
העיתוי האופטימלי של הזרקת הזרע התאיים (ICSI) הוא דאגה רצינית לתוכניות הפוריות, משום שערך זרע בטרם עת מצמצם את היכולת ההתפתחותית של הביצית. נוכחות של גוף הקוטב הראשון (PB) יחד עם ציר meiotic מציין השלמה של התבגרות oocyte ואת המוכנות של הביצה להפריה. בפרקטיקה הקלינית, נהוג להניח כי כל האוציטים המציגים PB הם בוגרים (MII) oocytes. עם זאת, PB ההבלטה לפני היווצרות של ציר MII דו-קוטבית. זה הופך את הנוכחות של PB לסמן לא אמין של בגרות oocyte. הדמיה של ציר שאינו פולשני באמצעות מיקרוסקופ אור מקוטב (PLM) מאפשר בדיקה קלה ומהירה של האם PB-הצגת oocyte למעשה הרכבנו ציר meiotic לפני ICSI. כאן, אנו מציגים פרוטוקול סטנדרטי כדי לבצע הערכה לפירעון ביצים אנושיים במעבדה הקלינית. אנו גם מראים כיצד למטב את הזמן של ICSI ביחס לשלב ההתפתחותי של oocyte על מנת למנוע הזרקת זרע מוקדמת של התבגרות מאוחרת oocytes. שימוש בגישה זו, אפילו בלתי בוגר הבלטת מיכל PB בתוך מבחנה יכול להיות מנוצל קלינית. הצהרה כי ציר MII נוכח לפני הזרקת זרע והתאמה אינדיבידואלית של הזמן של ICSI הוא חשוב במיוחד בפרוגנוזה נמוכה הפריה חוץ גופית (IVF) מחזורים עם מספר נמוך של oocytes זמין עבור הפריה.
Introduction
כדי להיות ביצת fertilizable פלואידי, את דיפלואידי oocyte יש להפוך את חצי המידע הגנטי שלה לתא הסמוך, נקרא גוף הקוטב הראשון (PB), וליישר כרומוזומים בתוך המשווה של מטשלב השני הדו (mii) ציר. בעוד PB יכול להיות בבירור נצפתה על ידי מיקרוסקופ אור קונבנציונאלי, זיהוי של חומרים גנטיים מבנים ציטולדים בדרך כלל דורש הכנה פולשנית שאינם תואמים את השימוש הנוסף של oocyte לטיפול בפוריות. מכאן, בפרקטיקה הקלינית, הנוכחות של PB הוא נחשב סימן ההיכר של בגרות oocyte. עם זאת, הדמיה חיה של מיקרוכדורית ודינמיקה כרומוזום במהלך התבגרות האדם oocyte גילה כי PB הופך להיות גלוי כמה שעות לפני ציר MII דו-קוטבית מורכב וכרומוזומים מיושרים1. עם זאת, באור המשודר, MII עצרה ביצים הם לא להבחין האוסטציטים אשר נכנס רק לתהליך של הפרדה כרומוזום. כך, קבוצה של oocytes, מסווג כ MII oocytes מבוסס רק על נוכחות PB, יכול להכיל latematuring רפתקאות oocytes שעדיין לא השלימו את התפתחותם ובכך אינם מוכנים הפריה.
עיכוב של התבגרות oocyte צפוי להשפיע על האוכלוסייה של המגיבים עניים עם מספר נמוך של MII oocytes ושיעור גבוה של oocytes בוגר שנאסף במפתיע ב מחזורי גירוי2. בvivo, רק ביצה אחת, באיכות הטובה ביותר משיגה בגרות והופכת ovulated. ב-הפריה חוץ גופית (IVF) מחזורים, השחלה מבוקרת חלתי משמש לגייס אוציטים מרובים להבשלה. גל גונדוטרופין מפעיל חידוש של התוכנית meiotic ואת ושלתי ביצה אמורים להגיע לשלב מעצר MII בתוך 36 שעות3. עם זאת, oocytes שאוחזרו preovulatory זקיקי לעתים קרובות מהווים מבחר של PBdisplaying MII oocytes ובלתי בוגר oocytes, או במטא I (MI) או שלפוחית העין בשלב (GV) (איור 1). רק MII oocytes חשופים הזרקת זרע תאיים (ICSI) בעוד oocytes בלתי בוגר הם בדרך כלל מושלך. עם זאת, כאשר מעובד בתוך מבחנה, MI oocytes משמשים בדרך כלל כדי הבלטת PB ב מבחנה. למרות הנחיתות הכללית שלהם, התבגרות מאוחרת oocytes אשר השלימה באופן ספונטני את החטיבה meiotic הראשון במהלך תרבות הלילה השתמשו בהצלחה כמשאב האחרון oocytes, ו לידות חי דווחו4,5 ,6,7,8. מכאן, ההזרקה בטרם עת של הזרע עשוי להיות הסיבה העיקרית בבסיס התוצאות התפתחותיות עניות של oocytes התבגרות מאוחרת דיווחו במחקרים קודמים9,10,11.
מיקרוסקופ אור מקוטב (PLM) בשילוב עם תוכנת עיבוד תמונה מאפשר הדמיה לא פולשנית של ציר meiotic ב-oocyte חי. השתקפות כפולה נוצרת על ידי אינטראקציה של קרן אור מקוטב עם הרכבה מסודרת מאוד של microtubules בניית הציר הדו. מאז אור מקוטב הוא בעוצמה נורמלית, הטכניקה יכולה לשמש בבטחה הגדרות קליניות כדי לראות את הדינמיקה של מנגנון החלוקה11,12,13,14. הנוכחות של ציר mii שבירה בתוך oocyte זוהה כסמן של יכולת התפתחותית של ביצה9,15,16,17,18, . 19,20,21,22,23 כך, הוצע כי הדמיה לא פולשנית הציר meiotic יכול לשמש לבקרת איכות ביצה בפרקטיקה קלינית11,14,20.
מאז ציר הזמן עבור הדינמיקה המיקרוצינורי במהלך מוזיקה oocyte נפתרה1, דפוס plm נצפתה יכול להיות קשור יותר לקורס הזמן של MI כדי mii המעבר. זמן קצר לאחר פליטת PB, הציר MII המתהווה הופך להיות בלתי ניתן לגילוי על ידי PLM. עם זאת, אם האוזציטים נשמרות בתרבות, האות השבירה עשוי לצוץ מאוחר יותר כאשר ציר של mii דו-קוטבית פורס9,10,11. כך, ב אוציטים הבלטת ממד PB ב מבחנה, העדר ציר יכול להיות רק זמני המתאים המעבר הפיזיולוגי של oocyte התבגרות מאוחרת מ-MI לשלב MII. אם אות MII הציר אינו ניתן לגילוי, הזרקת זרע יכול להיות נדחה לנקודת זמן מאוחרת יותר מתן זמן נוסף עבור היווצרות ציר MII. אופטימיזציה PLM בסיוע של זמן ICSI למקסם את הסיכוי של התבגרות מאוחרת oocytes להיות מנוצל קלינית ולעשות הבדל לחולים פרוגנוזה נמוכה9.
להלן, אנו מספקים פרוטוקול צעד אחר צעד של איך לבצע דימות ציר פולשני של האדם oocytes. אנו גם להדגים כיצד PLM יכול להיות מועסק כדי למנוע את הסיכון של הפריה מוקדמת של התבגרות מאוחרת oocytes.
Protocol
Representative Results
Discussion
הציר הגבוה ביותר של האוציטים בתאי האדם הוא דינמי מאוד ומבנה עדין1. בתנאים מיטביים, הסיבים המיקרוכדורית מהירים במהירות וצירים מיוכטיים מכילים30,31,32,33. מכאן, חשוב באופן ביקורתי כדי להבטיח כי התרבות oocyte ותנאי המיקרומניפולציה, כלומר טמפרטורה ו-pH הם בטווח האופטימלי. כדי למזער את הסיכון של שיבוש ציר, את oocytes יש לשמור בסביבה טמפרטורה מבוקרת שמירה על 37 ± 0.5 ° צ’ במדיה oocyte. השימוש במיקרוסקופים ובכיוונון מיקרוהזרקה המצויד בשלב מחומם הינו נדרש בלבד. כל מניפולציה עם oocytes מחוץ לחממה חייב להתבצע ב HEPES/מחלק מדיה באגירה כדי למנוע האוספים של pH. כדי למנוע תופעות לוואי פוטנציאליות של oocyte מוגזמת מסירת במצב הסביבה, הזמן הכולל של בדיקת PLM לא יעלה על 10 דקות. Oocytes צריך להיות מנותח על הצלחת התחתונה זכוכית עם מכסה פלסטיק הסיר מכיוון מיקום של פלסטיק רגיל בנתיב הקורה פוגע בניתוח תמונה. מכיוון פלסטיק זכוכית מנות בתחתית יש מאפיינים תרמיים שונים, הטמפרטורה יש לבדוק ישירות טיפות של טיפול בינוני בצלחת הבדיקה.
בנוסף לתנאי מעבדה, הבדלים פרוצדורליים וכישורי המיקרומניפולציה של המפעיל יכולים להשפיע על דיוק הבדיקה PLM. רק הצירים דו קוטבית מורכבים ביותר יכולים להיות מאוד לא פולשני. האות הנצפה פרופורציונאלית לדרגת הארגון המבני של הציר. נייסנט, אפאר, שחרר או עיוות הצירים מציגים רק שבירה מטושטשת או כלום בכלל (איור 3 ואיור 4). מלבד זאת, יישור לא מושלם של אור מקוטב עם מערכים זעירים מייצר רק מעבר שקוף ומוגדר למחצה, למרות הנוכחות הממשית של ציר דו-קוטבי מפותח (איור 4). אלא אם כן מונחה כראוי, אות הציר עשוי להיות מחמיץ בקלות הבגרות oocyte שאובחנו (וידאו משלים). עבור הדמיה הציר האופטימלי, oocyte צריך להיות כראוי סובב סביב כל ציר. מאז שבירה אינו גלוי בחתיכות עיניים, המפעיל צריך לצפות במסך המחשב תוך ביצוע סיבוב של oocyte. הניסיון הקודם עם מיקרומניפולציה והכשרה של הדמיה ציר העודף בתוך מבחנה הבשיל מתורבת הוא רצוי לפני מעבר ליישום קליני.
מלבד הציר, התאים קומולוס המקיפים את oocyte, oocyte, השכבה הפנימית של הסונה pellucida וכמה מבנים cytoplasmic (למשל, גופים שבירה, וחללים) התערוכה שבירה (איור 5A-D). אלא אם הוסר ביסודיות מן oocyte לפני הדמיה, תאים הזקיקים מחובר היטב לייצר רעשי רקע ולהתפשר זיהוי ציר meiotic. היזהרו לא לטעות גוף שבירה גדול עבור ציר. הכללות cytoplasmic רבים המתגוררים בציטופלסמה להציג בהירות גבוהה אשר ניגודים בחדות עם הרקע הכהה. הציר המיוטי, מצד שני, מוצג אות מתון בלבד, גבולות מטושטשים ובדרך כלל מתחבר ל-oolema מתחת או בסמוך ל-PB הראשון. מדי פעם, בדיקת PLM חושף סטייה ציר גולמי ממיקומה הסטנדרטי (איור 5E, F). אם יש חוסר התאמה משמעותי בין מנגנון החילוק ו PB, PLM עוזר לכוון את oocyte כדי למנוע את הסיכון של פציעה ציר במהלך מיקרוהזרקה. המיקום היחסי של הציר בתוך ה-oocyte אינו משפיע על הפוטנציאל ההתפתחותי של העוברים הנובעים17,34. עם זאת, כאשר הציר מתנתק מהאורמה, מומים דישון מתרחשים. באופן מעניין, כמה אוציטים באיכות ירודה עוברים ניתוח כרומטין מיד לאחר שחול ה-PB במקום להתחיל בתהליך המיקרו-כדורית (איור 4F). באמצעות מיקרוסקופ אור קונבנציונלי ו-PB כמו הסמן היחיד של בגרות oocyte, כגון זה sub-המוסמכת oocytes ייחשב fertilizable. כך, על גבי הערכה מורפולוגית שגרתית, הדמיה ציר מוסיף מידע חשוב על בגרות של ביצה יכול לשמש כסמן עקיף של האיכות שלה.
השכיחות של מסתובב MII oocytes הוא עשוי להיות מושפע מאפיינים של אוכלוסיית המחקר (למשל, רקע גנטי, מצב רפואי, גיל אימהי). בנוסף, החלק של הפיתוח התעכב oocytes בתוך הקוציטים ישפיע על מספר בפועל של הציר השלילי של כישור-שליליהתשעה,27. הדמיה ציר מיוטיק מאפשר לזהות בבירור fertilizable oocytes נעצר בשלב MII. יתר על כן, הבדיקה השנייה במועד מאוחר יותר עשוי לגלות אם הציר השלילי של הפלך הוא חריג או רק לאחרונה התקדמה באמצעות MI/mii מעבר9,10,11. כאשר מותר לפתח ציר לפני ICSI, אפילו אוציטים בוגרות, אשר מושלך באופן שגרתי, יכול לייצר עוברים קיימא9. במחזורים עם מעטים מאוד oocytes זמינים עבור הפריה, דק מתוזמן ICSI של הבלטת ממד של oocytes בתוך PB יכול לשמש כאסטרטגיית הצלה חלופה לביטול מחזור.
עם זאת, הארכת זמן טרום הדגירה לא צריך להיות כללית על כל האוציטים. ב vivo התבגר oocytes מן המגיבים הנורמליים בדרך כלל התערוכה מיאני ציר9,20,21,27. כאן, הסיכוי של הדמיה מוצלחת הציר פוחתת עם הזמן כתוצאה של post-ovulatory בהזדקנות מבחנה35. אם אפשרי, icsi יש לבצע ביום של אחזור ולא יעלה על 9 שעות (45 שעות פוסט hCG), התקופה המשויכת עם ירידה באיכות העובר כתוצאה36,37. Oocytes הצגת הצירים דו קוטבית ברורים צריך להיות נתון ICSI ללא עיכוב נוסף. לסיכום, אופטימיזציה אישית של העיתוי ICSI כדאי בחולים פרוגנוזה נמוכה להוציא כל סיכון של הזרקת זרע מוקדמת. עם זאת, זה לא נחוץ, זמן רב מדי ומפרך להתבצע בכל מחזורי IVF.
ניתוח PLM מגלה אם oocyte הגיע לשלב MII. עם זאת, הדמיה לא פולשנית של ציר meiotic אינו מספק מידע אודות ארגון כרומוזום. יכול להיות חמור בכרומוזום שגוי ו/או הקשורים גיל הקשורות כרומאטיד הקשור oocytes הכולל ציר דו קוטבית (איור 5). גורמים אחרים שונים יש השפעה משמעותית על הצלחה רבייה (למשל, גורם זרע, המיטוקטורים, הפעלת הגנום העובריים, מחשוף סדיר, אפיגנטיקה, רירית הספר, חסינות אימהית). לכן, זיהוי ציר MII למשל, אינו מבטיח תוצאה קלינית חיובית של הליך IVF.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנחנו רוצים להודות למעבדה האמבריולוגיה של האינטרנציונל החדש. אנו מכירים גם את מתקן הליבה CELLIM של CEITEC נתמך על ידי MEYS CR (LM2015062 צ’כית-Bioimaging) עבור התמיכה שלהם עם השגת נתונים הדמיה immunofluorescence הציג כאן.
Materials
| Continuous Single Culture Complete with Human Serum Albumin | Irvine Scientific | 90164 | bicarbonate based single-step culture medium for embryo culture |
| Denuding micropipette 150 µm | Microtech IVF | 005-150C | |
| Denuding micropipette 180 µm | Microtech IVF | 005-180B | suitable for oocyte transfer between dishes |
| Denuding micropipette 200 µm | Microtech IVF | 005-250-A | suitable for oocyte transfer between dishes |
| FluoroDish | World Precision Instruments | FD 5040-100 | glass-bottom dish |
| (alternative: WillCo-dish GWST-5040 WillCo Wells) | |||
| Holding micropipette | Microtech | 001-120-30 | sterile glass microneedles |
| Hyaluronidase solution | Irvine Scientific | 90101 | for oocyte denudation |
| ICSI micropipette | Microtech | 002-5-30 | sterile glass microneedles |
| Micro Droplet Culture Dish | Vitrolife | 16003 | 12-well plate for embryo culture |
| Multipurpose Handling Medium (MHM) with Gentamicin | Irvine Scientific | 90163 | handling medium, MOPS/HEPES buffered |
| Nikon Eclipse TE 2000-U | Nikon | inverted microscope with heated stage | |
| Nunc IVF Petri Dish, 60 mm | Thermo Fisher Scientific | 150270 | plastic ICSI dish |
| Nunc non-treated 4-well IVF dish | Thermo Fisher Scientific | 179830 | 4-well plate for embryo culture |
| OCTAX polarAide | MTG | integrated PLM system | |
| Oil for embryo culture | Irvine Scientific | 9305 | oil for overlay |
| Polyvinylpyrrolidone | Irvine Scientific | 90123 | for sperm immobilization prior to ICSI |
References
- Holubcova, Z., Blayney, M., Elder, K., Schuh, M. Human oocytes. Error-prone chromosome-mediated spindle assembly favors chromosome segregation defects in human oocytes. Science. 348 (6239), 1143-1147 (2015).
- Oudendijk, J. F., Yarde, F., Eijkemans, M. J., Broekmans, F. J., Broer, S. L. The poor responder in IVF: is the prognosis always poor?: a systematic review. Human Reproduction Update. 18 (1), 1-11 (2012).
- Gautam, N., Allahbadia, Y. M. . Ovarian Stimulation Protocols. , (2016).
- Piqueras, P., et al. Live birth after replacement of an embryo obtained from a spontaneously in vitro matured metaphase-I oocyte. Systems Biology in Reproductive Medicine. 63 (3), 209-211 (2017).
- Liu, J., Lu, G., Qian, Y., Mao, Y., Ding, W. Pregnancies and births achieved from in vitro matured oocytes retrieved from poor responders undergoing stimulation in in vitro fertilization cycles. Fertility and Sterility. 80 (2), 447-449 (2003).
- Shu, Y., et al. Fertilization, embryo development, and clinical outcome of immature oocytes from stimulated intracytoplasmic sperm injection cycles. Fertility and Sterility. 87 (5), 1022-1027 (2007).
- Sachdev, N. M., Grifo, J. A., Licciardi, F. Delayed intracytoplasmic sperm injection (ICSI) with trophectoderm biopsy and preimplantation genetic screening (PGS) show increased aneuploidy rates but can lead to live births with single thawed euploid embryo transfer (STEET). Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33 (11), 1501-1505 (2016).
- De Vos, A., Van de Velde, H., Joris, H., Van Steirteghem, A. In-vitro matured metaphase-I oocytes have a lower fertilization rate but similar embryo quality as mature metaphase-II oocytes after intracytoplasmic sperm injection. Human Reproduction. 14 (7), 1859-1863 (1999).
- Holubcova, Z., et al. Egg maturity assessment prior to ICSI prevents premature fertilization of late-maturing oocytes. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 36 (3), 445-452 (2019).
- Montag, M., Schimming, T., van der Ven, H. Spindle imaging in human oocytes: the impact of the meiotic cell cycle. Reproductive BioMedicine Online. 12 (4), 442-446 (2006).
- Montag, M., van der Ven, H. Symposium: innovative techniques in human embryo viability assessment. Oocyte assessment and embryo viability prediction: birefringence imaging. Reproductive BioMedicine Online. 17 (4), 454-460 (2008).
- Keefe, D., Liu, L., Wang, W., Silva, C. Imaging meiotic spindles by polarization light microscopy: principles and applications to IVF. Reproductive BioMedicine Online. 7 (1), 24-29 (2003).
- Caamano, J. N., Munoz, M., Diez, C., Gomez, E. Polarized light microscopy in mammalian oocytes. Reproduction in Domestic Animals. 45, 49-56 (2010).
- Eichenlaub-Ritter, U., Shen, Y., Tinneberg, H. R. Manipulation of the oocyte: possible damage to the spindle apparatus. Reproductive BioMedicine Online. 5 (2), 117-124 (2002).
- Wang, W. H., Meng, L., Hackett, R. J., Odenbourg, R., Keefe, D. L. The spindle observation and its relationship with fertilization after intracytoplasmic sperm injection in living human oocytes. Fertility and Sterility. 75 (2), 348-353 (2001).
- Wang, W. H., Meng, L., Hackett, R. J., Keefe, D. L. Developmental ability of human oocytes with or without birefringent spindles imaged by Polscope before insemination. Human Reproduction. 16 (7), 1464-1468 (2001).
- Moon, J. H., et al. Visualization of the metaphase II meiotic spindle in living human oocytes using the Polscope enables the prediction of embryonic developmental competence after ICSI. Human Reproduction. 18 (4), 817-820 (2003).
- Cohen, Y., et al. Spindle imaging: a new marker for optimal timing of ICSI?. Human Reproduction. 19 (3), 649-654 (2004).
- Rama Raju, G. A., Prakash, G. J., Krishna, K. M., Madan, K. Meiotic spindle and zona pellucida characteristics as predictors of embryonic development: a preliminary study using PolScope imaging. Reproductive BioMedicine Online. 14 (2), 166-174 (2007).
- Heindryckx, B., De Gheselle, S., Lierman, S., Gerris, J., De Sutter, P. Efficiency of polarized microscopy as a predictive tool for human oocyte quality. Human Reproduction. 26 (3), 535-544 (2011).
- Kilani, S., Cooke, S., Tilia, L., Chapman, M. Does meiotic spindle normality predict improved blastocyst development, implantation and live birth rates?. Fertility and Sterility. 96 (2), 389-393 (2011).
- Kilani, S., Chapman, M. G. Meiotic spindle normality predicts live birth in patients with recurrent in vitro fertilization failure. Fertility and Sterility. 101 (2), 403-406 (2014).
- Tilia, L., Venetis, C., Kilani, S., Cooke, S., Chapman, M. Is oocyte meiotic spindle morphology associated with embryo ploidy? A prospective cohort study. Fertility and Sterility. 105 (4), 1085-1092 (2016).
- ESHRE Guideline Group on Good Practice in IVF Labs, De los Santos, M. J., et al. Revised guidelines for good practice in IVF laboratories (2015). Human Reproduction. 31 (4), 685-686 (2016).
- Montag, M., Morbeck, D. . Principles of IVF Laboratory Practice: Optimizing Performance and Outcomes. , (2017).
- Chamayou, S., et al. Meiotic spindle presence and oocyte morphology do not predict clinical ICSI outcomes: a study of 967 transferred embryos. Reproductive BioMedicine Online. 13 (5), 661-667 (2006).
- Rienzi, L., et al. Relationship between meiotic spindle location with regard to the polar body position and oocyte developmental potential after ICSI. Human Reproduction. 18 (6), 1289-1293 (2003).
- Woodward, B. J., Montgomery, S. J., Hartshorne, G. M., Campbell, K. H., Kennedy, R. Spindle position assessment prior to ICSI does not benefit fertilization or early embryo quality. Reproductive BioMedicine Online. 16 (2), 232-238 (2008).
- Kilani, S., Cooke, S., Chapman, M. Time course of meiotic spindle development in MII oocytes. Zygote. 19 (1), 55-62 (2011).
- Wang, W. H., Meng, L., Hackett, R. J., Odenbourg, R., Keefe, D. L. Limited recovery of meiotic spindles in living human oocytes after cooling-rewarming observed using polarized light microscopy. Human Reproduction. 16 (11), 2374-2378 (2001).
- Sun, X. F., Wang, W. H., Keefe, D. L. Overheating is detrimental to meiotic spindles within in vitro matured human oocytes. Zygote. 12 (1), 65-70 (2004).
- Mullen, S. F., et al. The effect of osmotic stress on the metaphase II spindle of human oocytes, and the relevance to cryopreservation. Human Reproduction. 19 (5), 1148-1154 (2004).
- Swearman, H., et al. pH: the silent variable significantly impacting meiotic spindle assembly in mouse oocytes. Reproductive BioMedicine Online. 37 (3), 279-290 (2018).
- Rienzi, L., Vajta, G., Ubaldi, F. Predictive value of oocyte morphology in human IVF: a systematic review of the literature. Human Reproduction Update. 17 (1), 34-45 (2011).
- Miao, Y. L., Kikuchi, K., Sun, Q. Y., Schatten, H. Oocyte aging: cellular and molecular changes, developmental potential and reversal possibility. Human Reproduction Update. 15 (5), 573-585 (2009).
- Pujol, A., Garcia, D., Obradors, A., Rodriguez, A., Vassena, R. Is there a relation between the time to ICSI and the reproductive outcomes?. Human Reproduction. 33 (5), 797-806 (2018).
- Yanagida, K., et al. Influence of oocyte preincubation time on fertilization after intracytoplasmic sperm injection. Human Reproduction. 13 (8), 2223-2226 (1998).
