小鼠原发性颅神经冠细胞的解剖、培养与分析，用于神经冠细胞脱角和迁移研究

所有动物工作都经过伦敦国王学院道德审查流程的道德审查，并根据英国内政部项目许可证 P8D5E2773 （KJL） 进行。 1. 试剂制备 准备一般溶液和工具，包括无菌磷酸盐缓冲盐 （PBS）、70% 乙醇、解剖工具（钳子和解剖刀片或无菌针头）、塑料板或玻璃玻片，涂有市售的细胞外基质（）基于ECM）的水凝胶或纤维质（参见材料表）和神经峰介质（见下文）。 使用 Dulbecco 的改性 Eagle 培养基培养基培养基培养基（DMEM，4500 mg/L 葡萄糖）、15% 胎儿牛血清 （FBS）、0.1 mM 最小必需介质非必需氨基酸 （MEM NEAA 100X）、1 mM 焦化钠、55 μM β-美尔卡托乙醇、100单位/mL青霉素，100单位/mL链霉素，和2 mM L-谷氨酰胺。 使用生长抑制的STO进料细胞21调节介质过夜。 制备STO细胞（见材料表）介质，以含有10S和100U/mL青霉素、100 U/mL链霉素补充剂的DMEM。在涂有0.1%明胶的25厘米2瓶中，生长和扩大STO细胞汇合。应用5000 rad的伽马辐照。 将大约 3 x 106生长抑制细胞播种到 10 厘米2盘或 25 厘米2烧瓶上（从步骤 1.2.1.1）。加入大约10~12 mL的神经峰基底介质，并在一夜之间孵育。注：种子细胞可用于产生条件培养基长达10天。定期检查细胞的外观 过滤介质（0.22 μm孔径），并补充25纳克/mL基本成纤维细胞生长因子（bFGF）和1000 U的白血病抑制剂因子（LIF）。注：储存在4°C，并在一个月内使用或在-20°C储存，并在3个月内使用。 用细胞外基质涂覆组织培养表面。注：根据所问的生物问题，基质可以涂覆在玻璃底培养皿、塑料组织培养皿或玻璃盖滑片上。有关基于基质基板的不同基于 ECM 的水凝胶稀释，请参阅下文。Fibronectin 已在玻璃底盘上进行了测试，并且仅在下面指定的浓度下盖滑。在此，我们将基板涂层表面称为”涂层板”。 用基于ECM的水凝胶涂覆组织培养表面。注：通过冷却介质或保持冰上，使基板保持冷却，直到电镀。 在4°C下解冻水凝胶过夜。在 DMEM 中将 5 mL 的 10% FBS 添加到 5 mL 的水凝胶中，最终体积为 10 mL（参见材料表）。 使 0.5⁄1 mL 等分表示方便，并储存在 -20°C。 在冰上解冻水凝胶等分物。 使用 1：20 稀释水凝胶管用来涂覆塑料。 使用水凝胶库存的 1：5 稀释来涂覆玻璃玻片和玻璃底组织培养板。注：在冷DMEM 中稀释水凝胶。 在板/滑板上涂抹足够的稀释水凝胶，覆盖所需区域，并在 37°C 下孵育 30-45 分钟。 立即使用涂层板/滑轨，或在 4°C 处将涂布的幻灯片存放过夜。 使用前，请去除过量，用高葡萄糖 DMEM（可选）冲洗幻灯片。 用纤维化肌覆盖组织培养表面。 制作1mg/mL纤维素库存溶液的等分，储存在-80°C。稀释纤维素与Dulbecco的PBS（dPBS）到最终浓度为1μg/mL。 涂抹足够的纤维化，覆盖所需区域，并在室温下孵育15分钟。 去除残留的纤维化，让玻璃干燥30-45分钟。 使用前，使用高葡萄糖 DMEM（可选）冲洗井或盖滑。 2. 第1天：早期索米特阶段胚胎的解剖 注：使用无菌工具和无菌溶液。如果需要基因分型，收集胚胎的身体进行DNA提取。 颅神经板的解剖仅限于胚胎在8.5天后（dpc）。在5~8个胚接阶段选择胚胎。将子宫分解成PBS，切开中体以分离每个胚胎（图1A）。子宫的肌肉壁收缩和二元组织将变得可见（图1B）。注：在冰冷的PBS中保持子宫内胚胎，同时进行一次一个胚胎的解剖。用玻璃巴斯德移液器将胚胎移入新鲜无菌PBS，以提高可见度并减少污染。 在肌肉层和二元组织之间滑动钳子，用第二对钳子去除肌肉层（图1C）。 使用钳子，刺穿斜极边缘的二分体，并用第二对钳子撕裂，垂直地打开极点。 用钳子剥回二元组织，使赖歇特的膜可视化。 小心地取出赖歇特的膜。内脏蛋黄囊变得可见，胚胎可以看到内部 （图1D）。 取出内脏蛋黄囊和羊圈（图1E），并放置胚胎，以可视化头部褶皱（图1F）。 将头部折叠在心脏上方，使用钳子和/或睫毛工具刮去底层的中皮，以获得干净的神经板 （NP）（图 1H）。注： NP 可以保持整体或向下分离前方轴，以便每侧可以单独镀。神经板边界可以进一步修剪远离神经板，以尽量减少神经元对外植的贡献。 使用玻璃巴斯德移液器将解剖的神经板转移到装有条件神经波峰介质的水凝胶涂层盘中。 轻轻旋转盘子，将 NP 置于井中间。这对最大化活细胞成像的相位质量非常重要（第 2 天）。 在 5% CO2中，在 37°C 下孵育过夜（或到所需时间点）。神经峰细胞应该明显从神经板迁移出来。注：细胞通常在6~8小时内附着。在外植附加后，留出更多时间可视化迁移细胞。通常到24小时后，我们可以找到三个可区分的细胞群。第一个种群，在植物的中央，是神经板（NP）。第二个总体，即迁移前NC（pNC），在细胞的上皮片中环绕NP。第三个种群，在外环，由迁徙NC（mNC）组成，其大小较大，并且完全处于等位（图2）。 3. 第2天：鼠颅神经峰细胞的活细胞成像 注：成像应在24小时后进行切除，以最佳图像和量化神经峰细胞迁移。在活细胞成像之前，不需要刷新NC感应介质。需要使用倒置显微镜，带有电动舞台和内部环境室。使用适合成像的多井组织培养皿（材料表）。 显微镜设置 将环境室设置为 37°C 和 5% CO2。 将一个孔插入组织培养板盖盖，让CO2针连接到CO2加湿室，坐在板内。 将组织培养皿放入试样支架中，并胶带向下胶带盖板盖和 CO2针，以防止在多孔采集过程中晃动。 打开显微镜控制器、舞台控制器和成像软件。 以 10 倍放大倍率聚焦颅内数控细胞（在冷凝器中选择匹配相位环）。 通过调整显微镜设置手册中指定的场虹膜膜片、光圈虹膜膜和居心望远镜，在显微镜上设置高质量的相位对比。 相对比活细胞成像 设置将保存延时文件的目录或文件位置。 设置曝光时间、装箱和摄像机区域。 设置时间点数、成像持续时间和帧之间的时间间隔。 要量化NC细胞移位能力，将显微镜设置为10倍放大倍率，每5分钟取1帧（18小时多217个时间点）。要量化细胞形态，将放大倍率设置为 40 倍，取 1 帧/分钟（1 h 以上 61 个时间点）。要量化层压动力学，将放大倍率设置为 40 倍或 60 倍放大倍率，每 10 秒（超过 10 分钟）拍摄 1 帧。 对于多井成像，设置机械级以在选定的 XY 感兴趣位置之间移动。确认颅内NC细胞处于焦点，并且阶段位置正确。 使用”获取”命令开始延时成像。 完成延时成像后，查看多维数据并导出 .stk 文件进行分析。注：.stk 是一个 TIFF 堆栈文件。 退出软件，关闭计算机并关闭舞台、相机和显微镜控制器。 4. 成像分析：神经峰细胞迁移的定量 注：为了更好地定义迁移小鼠颅神经峰细胞所表现出的细胞行为，我们分析了一系列可量化的迁移参数，特别是迁移能力和细胞形状动力学。（1）迁移（累积距离）是像元 （μm） 获取的总路径长度;（2）迁移（欧氏距离）是单元（μm）初始位置和最终位置之间的直线距离;（3）迁移（细胞速度）是按单位时间（μm/min）的细胞行驶距离;（4）细胞形状（细胞面积）是细胞覆盖的总表面。根据成像显微镜将像素设置为微米刻度。（A =px x Npx，其中 Apx = 像素面积和 Npx = 像素数。单位： μm2;（5）细胞形状（细胞圆度）是细胞形状与完美圆的偏差，由 A = 面积和 P = 周长的圆度值 1.0 （4°（A/P2）表示。 单细胞跟踪注： 要测量 NC 细胞迁移，将生成所有延时帧中单个单元的 XY 坐标。这允许后续分析细胞迁移的距离、速度和持久性测量。 打开 ImageJ 并将数据导入为 TIFF 堆栈文件。 单击分析 |设置缩放以根据显微镜设置校准 .stk 文件，以像素/μm 为单位工作。 单击插件 |跟踪 |手动跟踪打开图像J手动细胞跟踪插件。要开始单元格跟踪，请选择”添加轨道”。 使用细胞核作为参考点，跟踪所有延时电影帧的细胞。注：每个外植细胞应跟踪10~20个细胞，共跟踪60个细胞（n = 3）。在延时过程中经历细胞分裂的细胞应排除在分析之外。 将结果保存并导出为 .csv 文件。结果表示所有帧上的各个单元格轨道编号、切片编号和 XY 坐标。 神经峰细胞迁移能力的定量 打开单个单元格跟踪数据（见上文）。将 .csv 文件转换为 .txt 文件格式。 打开迁移软件（材料表）。单击”导入数据”选项卡以将单元格跟踪数据作为 .txt 文件导入。 数据集下|初始化，选择要分析的切片或帧数，并设置 XY 校准和帧之间的时间间隔。选择”应用设置”以保存设置。 选择”绘图数据”符号以形成轨迹图。选择”统计”符号以量化距离和速度度量。 将轨迹图另存为位图 （.bmp） 文件，将距离和速度度量另存为 .txt 文件。选择”删除数据”符号。对其他延时文件重复上述步骤。注： 轨迹图可用于可视化给定细胞条件或延时电影过程中状态的单个细胞路径的定向（图4A）。存储在 .txt 文件中的距离和速度数据可用于进一步分析。 神经峰细胞面积和循环的定量 在 ImageJ 中打开延时 .stk 文件，并根据显微镜设置进行校准，以像素/μm 为单位工作。 下分析 |设置测量，单击以选择单元格形状参数：单元格区域、周长和形状描述符。 使用手绘选择工具，使用细胞膜边界作为参考，手动绘制每个细胞。 按键盘上的Ctrl + B键，以保持图像上的单元格轮廓。在每个延时帧上重复单元格。 使用图像 |叠加 |到 ROI 管理器来存储值。 概述了每个帧的所有感兴趣的单元格后，单击”测量”。将结果另存为 .csv 文件。注：应勾勒出每部影片中10~20个细胞，每个条件（n = 3）总共分析30~60个细胞。细胞形状数据（.csv文件）可用于量化细胞形状动力学如何随时间变化（图4C），或形态在不同细胞处理下如何改变。