Aquí se presenta un protocolo para la realización de la transferencia de energía de resonancia de una sola molécula de la resonancia de la unidad para estudiar la resolución hj. La excitación alterna de dos colores se utiliza para determinar las constantes de disociación. El smFRET de lapso de tiempo de un solo color se aplica en ensayos de escisión en tiempo real para obtener la distribución del tiempo de permanencia antes de la resolución de HJ.
Los métodos a granel miden el comportamiento del conjunto de moléculas, en el que las tasas de reacción individuales de los pasos subyacentes se promedian en toda la población. La transferencia de energía de resonancia de una sola molécula (smFRET) proporciona un registro de los cambios de conformación que tienen lugar las moléculas individuales en tiempo real. Por lo tanto, smFRET es potente en la medición de cambios estructurales en la enzima o sustrato durante la unión y la catálisis. Este trabajo presenta un protocolo para la toma de imágenes de una sola molécula de la interacción de una unión Holliday de cuatro vías (HJ) y una endonucleasa I (GEN1), una enzima de recombinación homóloga citosolílica. También se presentan los protocolos experimentales smFRET de excitación alterna de un solo color y dos colores (ALEX) para seguir la resolución del HJ por GEN1 en tiempo real. La cinética de la dimitación GEN1 se determina en el HJ, que se ha sugerido para desempeñar un papel clave en la resolución del HJ y ha permanecido esquiva hasta ahora. Las técnicas descritas aquí se pueden aplicar ampliamente para obtener valiosas perspectivas mecanicistas de muchos sistemas de ADN enzimático.
Los métodos de una sola molécula basados en la detección de fluorescencia proporcionan altas relaciones señal-ruido1. FRET es una técnica espectroscópica que puede medir distancias en el rango de 1-10 nm, haciendo esta técnica como una regla molecular para medir distancias en el rango de nanómetros2,3. El espectro de absorción del aceptador tiene una superposición espectral parcial con el espectro de emisión del donante en el extremo de longitud de onda más corto. FRET está mediada por la transferencia de energía sin radiación entre un donante y un par de aceptadores, mientras que la eficiencia de la transferencia de energía depende de la distancia y la orientación del aceptador4.
Se han implementado varios enfoques para minimizar el fondo y mejorar la eficiencia de detección de la señal de fluorescencia5,6. Un enfoque es la microscopía confocal, en la que un agujero restringe el punto de excitación a un tamaño por debajo del límite de difracción7. Otro enfoque es la fluorescencia de reflexión interna total (TIRF), que es una técnica de iluminación de campo amplio en la que la luz se dirige fuera del eje por encima de un ángulo crítico8. La luz se refleja totalmente internamente en la interfaz entre el vidrio y la solución acuosa, generando una onda evanescente que sólo ilumina los fluoróforos unidos a la superficie del vidrio y evita que el fondo de los fluoróforos en el resto de la solución.
En la microscopía confocal, las moléculas pueden ser libremente difuminadas o inmovilizadas en la superficie. La resolución temporal alcanzada puede ser dentro de microsegundos a varios milisegundos9. La detección confocal para una sola molécula se realiza mediante diodo de avalancha de un solo fotón (SPAD) y escaneo punto por punto de la región de interés10. En TIRF, una serie temporal de unos pocos cientos de moléculas inmovilizadas en la superficie es registrada por un detector acoplado de carga bidimensional (CCD) sensible a la posición. El CCD amplifica la señal de fluorescencia ya sea por pantalla de fósforo intensificada y placa de microcanal o multiplicación en chip de fotoelectrones (EMCCD). La resolución temporal depende de la velocidad de lectura y la eficiencia cuántica del CCD y, por lo general, del orden de unas pocas decenas de milisegundos6.
HJ es un intermediario central en reparación y recombinación de ADN11,12,13,14. HJ tiene dos hilos de cruce continuos y dos que se conectan entre las hebras continuas sin intersecar entre sí. HJ existe en solución como conformadores apilados por X, que se someten a la isomerización continua por las hebras continuas que se convierten en cruce y las hebras de cruce se vuelven continuas en el otro conformador15. La preferencia isómero del HJ depende de la secuencia central y del entorno iónico y ha sido ampliamente estudiada por FRET16,17,18,19.
GEN120 es una proteína monomérica en la solución21 y requiere dimerización para aparar el HJ, permitiendo así una separación adecuada de las hebras recombinadas22,23. La preferencia conformadora de apilamiento del HJ influye en el resultado de la recombinación genética estableciendo la orientación de la resolución por el HJ resolvases24. Comprender cómo GEN1 une el HJ, coordina las dos incisiones y asegura que su resolución completa ha sido todo bajo estudio intensivo21,22,23,25,26 ,27,28,29,30.
En este estudio, se utiliza una configuración TIRF basada en objetivos como se describió anteriormente31. La excitación alterna de dos colores (ALEX) se aplica para determinar los cambios de conformación tras la interacción de GEN1 con el fluoróforo con la etiqueta HJ. ALEX produce histogramas 2D basados en dos parámetros ratiométricos de eficiencia FRET E, que depende de la distancia donante-aceptador, y el parámetro S de estequiometría, que mide la estequiometría donante-aceptador32. ALEX permite la clasificación de especies fluorescentes basadas en las estequiometrías de los fluoróforos, incluyendo subpoblaciones sólo de donantes, sólo para pagos y mixtas. ALEX puede extender el uso de FRET a toda la gama y puede detectar diferencias en el brillo y el oligomerización de los fluoróforos, así como monitorear las interacciones entre macromoléculas y ligandos33.
Se constata que GEN1 logra resolver constantemente el HJ durante la vida útil del complejo GEN1-HJ. Los cambios de conformación dependientes del tiempo se derivan de los rastros de tiempo de moléculas individuales, mientras que los histogramas representan la distribución de las poblaciones subyacentes. Utilizando EL FRET de un solo color de lapso de tiempo, se demuestran velocidades de ajuste rápidas y bajas de velocidad lenta para el dimer GEN1, que aumentan la afinidad del dimer GEN1 ensamblado en el primer producto de incisión.
En este estudio, se implementaron diferentes técnicas de smFRET para determinar la cinética de la resolución HJ por GEN130. Se utilizaron enfoques similares de smFRET para seguir el requisito de conformación del ADN de doble aleta y el escote por la replicación del ADN y reparar la colgajo endonucleasa 142,43,44. Aquí, se discuten los pasos críticos en este protocolo. La reacción de silanización debe estar libre de cualquier rastro de humedad. La solución de pegilación se debe aplicar rápidamente en el vidrio silanizado una vez que se disuelva PEG para evitar la hidrólisis. En la celda de flujo multicanal, se debe eliminar cualquier aire atrapado en la hoja adhesiva para evitar fugas entre los canales vecinos. La solución de PCA debe estar recién preparada ya que se oxida con el tiempo. La adición de 10 N NaOH debe ser dropwise, con vórtice en el medio. El fondo de fluorescencia en el cubreobjetos debe ser mínimo antes de fluir el HJ con etiqueta fluorescente. Las imágenes en la célula de flujo se deben realizar en una dirección para evitar las imágenes en áreas blanqueadas. En los experimentos CON ALEX, se debe reducir la potencia del láser rojo para evitar el blanqueo rápido del aceptador. En los experimentos de lapso de tiempo, el tiempo de ciclo tiene que ser más corto que el evento más rápido.
smFRET es una técnica sensible que puede proporcionar valiosas perspectivas en tiempo real en reacciones biomoleculares. Sin embargo, este método tiene varios desafíos técnicos, entre los que se encuentra el logro de un cambio medible en FRET durante la reacción bioquímica. Esto es necesario para obtener entidades bien separadas en los histogramas y estados distinguibles en los seguimientos de tiempo. En muchos casos, smFRET requiere un diseño cuidadoso de los sustratos, la selección de los pares de fluoróforos y sus posiciones, y la amplificación de los cambios de FRET en el sustrato de ADN debido a los pequeños cambios estructurales en el sustrato45. Otro enfoque para realizar FRET es utilizar proteínas etiquetadas46. La ventana de observación en FRET está limitada por la estabilidad del aceptador como Cy5 o Alexa Fluor 647 que tiende a blanquear más rápidamente que el donante (Cy3 en este caso). Por lo tanto, FRET requiere una búsqueda continua de fluoróforos estables para extender la duración del experimento y los esfuerzos para desarrollar sistemas de barrido de oxígeno para prolongar la señal de fluorescencia y maximizar la relación señal-ruido47,48 .
Entre los consejos para la solución de problemas en smFRET está el equilibrio de los diversos parámetros involucrados en la imagen, como la potencia del láser, el tiempo de exposición, el tiempo de ciclo y el número de ciclos para maximizar la emisión de fluorescencia, prolongar la duración del experimento y lograr intervalos de muestreo adecuados para la dinámica enzimática. Los tiempos de observación más largos y los efectos mínimos del fotoblanqueo son esenciales para obtener distribuciones de tiempo de permanencia de alta fidelidad que representan la dinámica enzimática. ALEX genera mejores histogramas ya que este método está sujeto a menores contribuciones de partículas fotoblanqueadas en comparación con FRET de un solo color. Sin embargo, la resolución temporal en ALEX es menor que la de FRET de un solo color.
Por último, el énfasis de smFRET en la detección de cambios conformacionales/estructurales en moléculas individuales en tiempo real cierra la brecha entre las técnicas estructurales de alta resolución (es decir, cristalografía de rayos X, resonancia magnética nuclear, microscopía electrónica), que proporciona detalles estructurales de resolución atómica en condiciones estáticas y métodos a granel que producen el promedio de conjunto de una propiedad medible. En muchos aspectos, smFRET ha demostrado ser una técnica poderosa para estudiar sistemas biológicos en tiempo real.
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue apoyado por la Universidad De Ciencia y Tecnología Rey Abdullah a través de la financiación básica y el Premio de Investigación Competitiva (CRG3) a S. M. H.
(±)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid (Trolox) | Sigma-Aldrich | 238813 | |
0.1 M sodium bicarbonate buffer | Fisher | 144-55-8 | |
10 % Novex Tris-Borate-EDTA gel | Thermo Fisher Scientific | EC6275BOX | |
100 X TIRF objective | Olympus | NAPO 1.49 | |
3,4-dihroxybenzoic acid (PCA) | Sigma-Aldrich | P5630 | |
3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) | Sigma-Aldrich | 741442 | |
6% Novex Tris-Borate-EDTA gel | Thermo Fisher Scientific | EC6265BOX | |
Adhesive sheet | Grace bio-labs | SA-S-1L | |
Benchtop refrigerated centrifuge | Eppendorf | Z605212 | |
Biotin-PEG | Laysan Bio | Biotin-PEG-SVA 5000 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | New England Biolabs | B9001S | |
Calcium Chloride Dihydrate | Sigma-Aldrich | 31307 | |
cation exchange column | GE healthcare | MonoS (4.6/100) | |
Cell distruptor | Constant Cell Disruption System | TS5/40/CE/GA | |
Coomassie Brilliant Blue | MP Biomedicals | 808274 | |
Cy3 emission filter | Chroma | HQ600/40M-25 | |
Cy5/Alexa Fluor 647 emission filter | Chroma | HQ700/40M-25 | |
Dichroic for DV2 filter cube | Photometrics | 630dcxr-18×26 | |
Dithiothreitol (DTT) | Thermo Scientific | R0861 | |
Drill | Dremel | 200-1/21 | |
Electronic cutter | Copam | CP-2500 | |
EMCCD camera | Hamamatsu | C9100-13 | |
Epoxy glue | Devcon | 14250 | |
FPLC Aktapurifier UPC 10 | GE Healthcare | 28406268 | |
GelQuant.NET software | biochemlabsolutions.com | Version 1.8.2 | |
GEN1 entry vector | Harvard plasmid repository | HSCD00399935 | |
Glycerol | Sigma Life Science | G5516 | |
green laser (emission 532 nm) | Coherent | Compass 315M-100 | |
Heparin column | GE healthcare | HiTrap Heparin column | |
HEPES | BDH | BDH4162 | |
Image splitter | Photometrics | Dualview (DV2) | |
Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
Inverted microscope | Olympus | IX81 | |
Isopropyl-ß-D-thiogalactoside (IPTG) | Goldbio. | 12481C100 | |
Laser scanner | GE healthcare | Typhoon Trio | |
LB Broth | Fisher Scientific | BP1426-500 | |
Long pass 532nm filter | Semrock | LPD02-532RU-25 | |
Magnesium Chloride | Sigma Life Science | M8266 | |
mPEG | Laysan Bio | mPEG-SVA 5000 | |
Neutravidin | Pierce | 31000 | |
Ni-NTA column | GE healthcare | HisTrap FF | |
NuPAGE 10% Bis-Tris gels | Novex Life technologies | NP0301BOX | |
NuPAGE 10% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | NP0302PK2 | |
Origin software | OriginLab Corporation | Version 8.5 | |
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Alexis Biochemicals | 270-184-G025 | |
Phosphate-buffered saline | GIBCO | 14190 | |
Polyethylene Tubing (I.D. 0.76 mm O.D. 1.22mm) | Fisher (Becton Dickinson) | 427416 | |
Protocatechuate 3,4-dioxygenase (3,4-PCD) | Sigma-Aldrich | P8279-25UN | |
Quad-band dichroic | Chroma Inc | Z405/488/532/640rpc | |
red laser (emission 640 nm) | Coherent | Cube 640 100C | |
Sodium Chloride | Fisher Chemical | S271 | |
Sorvall RC-6 plus centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 46910 | |
Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | Nanodrop 2000 | |
Syringe pump | Harvard Apparatus | 70-3007 | |
Teflon tweezers | Rubis | K35A | |
Tris Base | Promega | H5135 | |
Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima L-90K | |
Ultrafiltration membrane | Millipore | UFC90300 |