Cuantificación de la dinámica de la red de interacción de proteínas mediante coinmunoprecipitación multiplexada

Las interacciones dinámicas proteína-proteína constituyen las cascadas de señalización molecular y las estructuras móviles que son la base funcional de la mayoría de la fisiología celular¹. Estos procesos a menudo se representan como vías de señalización lineal que cambian entre estados estables basados en entradas individuales, pero los datos experimentales y de modelado muestran claramente que funcionan como redes integradas^{2,3, 4}. En el caso de las proteínas G, diferentes receptores a menudo tienen la capacidad de activar la misma proteína G, y un solo receptor también puede activar más de un tipo de proteína G^5,6. Para que el número relativamente pequeño de clases de proteínas G modula específicamente una amplia gama de funciones celulares como la transmisión sináptica, la regulación hormonal y la migración celular, las células deben integrar y diferenciar estas señales^{4 , 5}. La evidencia ha demostrado que esta especificidad de la señal, tanto para las proteínas G como para otras, se deriva principalmente sobre la base de interacciones proteína-proteína finamente afinadas y su dinámica temporal^{1,3, 4 , 5 , 6 , 7}. Debido a que las redes de señalización se componen de complejos proteicos dinámicos con múltiples entradas, salidas y bucles de retroalimentación, una sola perturbación tiene la oportunidad de alterar el equilibrio homeostático general de la fisiología^{4 de una célula ,7}. Ahora se acuerda ampliamente que la señalización debe ser examinada desde una perspectiva de red con el fin de comprender mejor cómo la integración de múltiples entradas controla las funciones celulares discretas en la salud y la enfermedad^{7,8, 9,10,11,12,13}. A la luz de esto, se desarrolló la Inmunoprecipitación Múltiple Cuantitativa (QMI) para recopilar datos cuantitativos de rendimiento medio sobre los cambios de pliegue en las redes dinámicas de interacción de proteínas.

QMI es un ensayo basado en anticuerpos en el que el lisato celular se incuba con un panel de anticuerpos de inmunoprecipitación que se acoplan covalentemente a cuentas magnéticas que contienen proporciones distintas de colorantes fluorescentes. Tener anticuerpos específicos acoplados a distintas clases de cuentas magnéticas permite la co-inmunoprecipitación simultánea de múltiples proteínas diana del mismo lisato. Después de la inmunoprecipitación (IP), las perlas magnéticas se incuban con un segundo anticuerpo de sonda conjugada con fluoróforo (o anticuerpo biotinilado junto con estreptavidina conjugada con fluoróforo). Las coasociaciones entre las proteínas reconocidas por cada par de anticuerpos de anticuerpos IP- sondeo, o PiSCES (proteínas en complejos compartidos detectados por epítopos de superficie expuestos), se detectan por citometría de flujo y se pueden comparar cuantitativamente entre diferentes condiciones de la muestra¹⁴. Las ilustraciones de la Figura 1 muestran los pasos necesarios para ejecutar un ensayo QMI, incluido un diagrama de cuentas magnéticas con complejos proteicos inmunoprecipitados etiquetados por anticuerpos de sonda conjugados fluorescentes (Figura1C).

La sensibilidad de QMI depende de la concentración proteica del lisado en relación con el número de perlas magnéticas utilizadas para la inmunoprecipitación, y lograr una resolución para detectar cambios de pliegue del 10% requiere sólo una pequeña cantidad de material de partida en comparación con otros métodos co-IP^14,15. Por ejemplo, la cantidad de material de partida utilizado en QMI es similar a la necesaria para un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas sándwich (ELISA), pero se detectan múltiples interacciones en un solo ensayo QMI. Los ensayos QMI con 20 IP y 20 dianas de sonda se han realizado utilizando células T primarias de 1-5 x 10⁵ aisladas de una biopsia de piel de 4 mm, preparaciones sinapscontraómicas P2 a partir de una sección coronal de 3 mm de corteza prefrontal del ratón, o 3 x 10⁶ neuronas corticales^14,16,17. Esta sensibilidad hace que QMI sea útil para el análisis de células o tejidos con disponibilidad limitada, como muestras clínicas.

QMI se puede adaptar para cualquier red de interacción proteica previamente definida (siempre que los anticuerpos estén disponibles), y hasta la fecha se ha desarrollado para analizar el señalosoma del receptor de antígeno de células T (TCR) y un subconjunto de proteínas en las sinapsis glutamatérgicas en las neuronas ^{17 , 18}. En estudios de señalización de receptores de células T, QMI se utilizó primero para identificar los cambios inducidos por la estimulación en PiSCES, y luego para distinguir a los pacientes autoinmunes de un grupo de control, detectar la señalización autoinmune endógena, y finalmente para generar una hipótesis que implica una subred de interacciones asociada a la enfermedad desequilibrada¹⁴. Más recientemente, se utilizó el mismo panel QMI para determinar que la selección de timocitos está determinada por diferencias cuantitativas en lugar de cualitativas en la señalización proteica asociada a la TCR¹⁹. En las neuronas, QMI se utilizó para describir la reorganización específica de la entrada de una red de interacción proteica para distintos tipos de señales de entrada de una manera que apoya los nuevos modelos de plasticidad sináptica¹⁷. Además, este panel QMI sináptico se utilizó para identificar diferencias en siete modelos de ratón de autismo, agrupar los modelos en subgrupos basados en sus biofirmas PiSCES, e hipotetizar con precisión un déficit molecular compartido que antes no era reconocido en uno de los modelos¹⁶. Un enfoque similar podría utilizarse para detectar otros subgrupos que podrían responder a diferentes tratamientos farmacológicos, o asignar medicamentos a subgrupos específicos con capacidad de respuesta. QMI tiene aplicaciones potenciales en diagnóstico, sub-tipado de pacientes y desarrollo de medicamentos, además de ciencia básica.

Para ensamblar un panel de anticuerpos QMI, los protocolos iniciales de selección y cribado de anticuerpos se describen en la Sección 1, a continuación. Una vez identificados los paneles de anticuerpos, los protocolos para la conjugación de los anticuerpos seleccionados con las perlas magnéticas para IP y para la biotinylación de los anticuerpos de sonda seleccionados, se describen en la Sección 2. El protocolo para ejecutar el ensayo QMI en los líticos celulares o tisulares se describe en la Sección 3. Por último, dado que un solo experimento puede generar puntos de datos individuales de 5 x 10 5, las instrucciones y los códigos informáticos para ayudar en el procesamiento, análisis y visualización de datos se proporcionan en la Sección 4. En la Figura 1se muestra una descripción general del flujo de trabajo descrito en las secciones 2-4.