Een semi-High-throughput adaptatie van de NADH-gekoppelde ATPase-assay voor het screenen van kleine molecuul remmers
Summary
A Nicotinamide adenine dinucleotide (NADH)-gekoppelde ATPase-assay is aangepast aan de semihoge doorvoer screening van kleine molecuul myosine-remmers. Deze kinetische test wordt uitgevoerd in een 384-well microplaat Format met een totaal reactievolume van slechts 20 μL per put. Het platform moet van toepassing zijn op vrijwel elk ADP-producerende enzym.
Abstract
ATPase enzymen maken gebruik van de vrije energie opgeslagen in adenosinetrifosfaat om een grote verscheidenheid van endergonische biochemische processen in vivo te katalyseren die niet spontaan zouden optreden. Deze eiwitten zijn cruciaal voor in wezen alle aspecten van het cellulaire leven, met inbegrip van metabolisme, celdeling, reacties op veranderingen in het milieu en beweging. Het protocol hier gepresenteerd beschrijft een Nicotinamide adenine dinucleotide (NADH)-gekoppelde ATPase assay die is aangepast aan de semi-hoge doorvoer screening van kleine molecule ATPase remmers. De assay is toegepast op cardiale en skeletspier myosine II, twee actin gebaseerde moleculaire motor ATPases, als een bewijs van principe. De hydrolyse van ATP is gekoppeld aan de oxidatie van NADH door enzymatische reacties in de assay. Ten eerste wordt de door de ATPase gegenereerde ADP geregenereerd naar ATP door pyruvaat kinase (PK). PK katalyseert de overgang van fosfoenolpyruvate (PEP) naar pyruvaat parallel. Vervolgens wordt pyruvaatverlaagd tot lactaat door lactaat dehydrogenase (LDH), wat de oxidatie van NADH parallel katalyseert. Zo is de afname van de ATP-concentratie direct gecorreleerd aan de afname van de concentratie NADH, die wordt gevolgd door verandering in de intrinsieke fluorescentie van NADH. Zolang PEP beschikbaar is in het reactiesysteem, blijft de ADP-concentratie zeer laag, waardoor remming van het ATPase-enzym door zijn eigen product wordt vermeden. Bovendien blijft de ATP-concentratie vrijwel constant, wat lineaire tijdvakken oplevert. De fluorescentie wordt continu bewaakt, waardoor een eenvoudige schatting van de kwaliteit van de gegevens mogelijk is en helpt bij het filteren van mogelijke artefacten (bijvoorbeeld als gevolg van samengestelde neerslag of thermische veranderingen).
Introduction
Myosins zijn mechanochemische energie transducers die adenosinetrifosfaat (ATP) hydrolyseren om richtings bewegingen te genereren langs de filamenten van het actine cytoskelet in eukaryoten1,2. Ze hebben zowel structureel als kinetisch aangepast aan hun verschillende intracellulaire functies, zoals het transport van organellen, spiercontractie of de aanmaak van cytoskelet spanning1,2. De myosin superfamilie wordt vertegenwoordigd door ~ 40 myosin genen die behoren tot ~ 12 verschillende myosin klassen in het menselijk genoom3,4. Leden van de myosin klassen spelen verschillende rollen in een zeer diverse set van aandoeningen, zoals verschillende kankers, neurologische aandoeningen, skelet myopathieën, en Hypertrofische cardiomyopathie5,6. Gezien het grote aantal fysiologische en pathologische functies van deze moleculaire motoren, het is niet verwonderlijk dat ze steeds meer worden erkend als drugs doelen voor een verscheidenheid van voorwaarden7. Er is recentelijk aanzienlijke vooruitgang geboekt in de ontdekking van nieuwe myosine-remmers8,9,10 en Activators11, en om de eigenschappen van bestaande te verbeteren12, 13 , 14 , 15.
De Nicotinamide adenine dinucleotide (NADH)-gekoppelde ATPase-assay is al lange tijd gebruikt om de ATPase-activiteit van verschillende enzymen te meten, zoals de sarcoplasmorische reticulum CA2 + pomp ATPase16, de DNA-reparatie ATPase RAD5417, de AAA + ATPase P9718 of de microtubulus motor kinesin19. Bij de assay wordt een ATP-regeneratiecyclus gebruikt. De adenosine difosfaat (ADP) gegenereerd door de ATPase wordt geregenereerd naar ATP door pyruvaat kinase (PK), die transformeert één molecule van fosfoenolpyruvate (PEP) pyruvaat parallel. Vervolgens wordt pyruvaatverlaagd tot lactaat door lactaat dehydrogenase (LDH). Dat, op zijn beurt, oxiderende een molecuul van NADH naar NAD. Daarom is de afname van de NADH-concentratie als functie van de tijd gelijk aan de ATP-hydrolysesnelheid. De ATP-regeneratiecyclus houdt de ATP-concentratie bijna constant en de ADP-concentratie laag zolang PEP beschikbaar is. Dit resulteert in lineaire tijd cursussen, waardoor het eenvoudig is om de initiële reactiesnelheden te bepalen en helpt bij het voorkomen van product remming door ADP19. Hoewel de NADH-gekoppelde ATPase-assay al is aangepast aan een 96-well formaat20, maken de hoge reactievolumes (~ 150 μL) het relatief duur vanwege de hoge vraag van reagentia, waardoor het minder vatbaar is voor een snelle screening van grote aantallen Verbindingen. Alternatieve methoden, zoals de Malachiet groene assay19,21, die berust op de opsporing van het fosfaat dat wordt geproduceerd door het ATPase-enzym, bleken geschikter te zijn voor miniaturisatie en screening met hoge doorvoer22 , 23 , 24. een eindpunt test heeft echter meer kans om beïnvloed te worden door verschillende artefacten (hieronder besproken), die onontdekt kunnen blijven bij afwezigheid van voltijdse cursussen.
Hier is de NADH-gekoppelde ATPase-assay geoptimaliseerd voor de semi-hoge doorvoer screening van kleine molecuul remmers. Skelet en cardiale spier myosine II en de myosin-remmers blebbistatine8, para-aminoblebbistatine13 en para-nitroblebbistatine12 worden gebruikt om de kracht van de test aan te tonen, die gebaseerd is op NADH fluorescentie als uitlezen. Dit protocol is vatbaar voor screening van projecten gericht op elke ADP-producerende enzymen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritieke stappen in het Protocol
Optimaliseer de plaat indeling door meerdere platen met alleen negatieve controle uit te voeren (ATPase-reactie zonder remmer). Inspecteer de resultaten zorgvuldig op patronen in reactiesnelheden. Deze kunnen bijvoorbeeld voortvloeien uit randeffecten en/of onvolkomenheden in de hydrofiele oppervlaktecoating van “niet-bindende” platen. Als een patroon wordt waargenomen, wijzigt u het plaat type en/of de plaat indeling om de artefacten te minima…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door een subsidie van het National Institute of neurologische aandoeningen en beroerte en National Institute on drug abuse NS096833 (CAM).
Materials
| 384-well Low Flange Black Flat Bottom Polystyrene NBS Microplate | Corning | 3575 | |
| ATP (Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate) | Sigma | A7699 | |
| Aurora FRD-IB Dispenser | Aurora Discovery, Inc. | 00017425 | |
| Biomek NXP Multichannel Laboratory Automation Workstation | Beckman Coulter | A31841 | |
| Blebbistatin | AMRI | N/A | Custom synthesis |
| BSA (Bovine Serum Albumin, Protease-Free) | Akron Biotech | AK1391 | |
| Centrifuge 5430 R, refrigerated, with Rotor FA-35-6-30 | Eppendorf | 022620663 | |
| Centrifuge 5430, non-refrigerated, with Rotor A-2-MTP | Eppendorf | 022620568 | |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide) | Sigma | D2650 | |
| DTT (DL-Dithiothreitol) | Sigma | D5545 | |
| E1 ClipTip Multichannel Pipette; 384-format; 8-channel | Thermo Scientific | 4672010 | |
| E1 ClipTip Multichannel Pipette; 96-format; 8-channel | Thermo Scientific | 4672080 | |
| EGTA (Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid) | Sigma | E3889 | |
| EnVision 2104 Multilabel Plate Reader | PerkinElmer | 2104-0010 | |
| Glycerol | Sigma | G2025 | |
| LDH (L-Lactic Dehydrogenase from rabbit muscle) | Sigma | L1254 | |
| MgCl2.6H2O (Magnesium chloride hexahydrate) | Sigma | M2670 | |
| Microplate Shaker | VWR | 12620-926 | |
| Microplate, 384 well, PP, Small Volume, Deep Well, Natural | Greiner Bio-One | 784201 | |
| MOPS (3-(N-Morpholino)propanesulfonic acid) | Sigma | M1254 | |
| Myosin Motor Protein (full length) (Bovine cardiac muscle) | Cytoskeleton | MY03 | |
| Myosin Motor Protein (full length) (Rabbit skeletal muscle) | Cytoskeleton | MY02 | |
| NADH (β-Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced disodium salt hydrate) | Sigma | N8129 | |
| NaN3 (Sodium azide) | Sigma | 71289 | |
| NaOH (Sodium hydroxide) | Sigma | S8045 | |
| Optical Filter CFP 470/24nm (Emission) | PerkinElmer | 2100-5850 | Barcode 240 |
| Optical Filter Fura2 380/10nm (Excitation) | PerkinElmer | 2100-5390 | Barcode 112 |
| Optical Module: Beta Lactamase | PerkinElmer | 2100-4270 | Barcode 418 |
| OriginPro 2017 software | OriginLab | N/A | |
| para-Aminoblebbistatin | AMRI | N/A | Custom synthesis |
| para-Nitroblebbistatin | AMRI | N/A | Custom synthesis |
| PEP (Phospho(enol)pyruvic acid monopotassium salt) | Sigma | P7127 | |
| PK (Pyruvate Kinase from rabbit muscle) | Sigma | P9136 | |
| Rabbit Muscle Acetone Powder | Pel Freez Biologicals | 41995-2 |
References
- Heissler, S. M., Sellers, J. R. Kinetic Adaptations of Myosins for Their Diverse Cellular Functions. Traffic. 17 (8), 839-859 (2016).
- Hartman, M. A., Spudich, J. A. The myosin superfamily at a glance. Journal of Cell Science. 125 (Pt 7), 1627-1632 (2012).
- Berg, J. S., Powell, B. C., Cheney, R. E. A millennial myosin census. Molecular Biology of the Cell. 12 (4), 780-794 (2001).
- Sebe-Pedros, A., Grau-Bove, X., Richards, T. A., Ruiz-Trillo, I. Evolution and classification of myosins, a paneukaryotic whole-genome approach. Genome Biology and Evolution. 6 (2), 290-305 (2014).
- Newell-Litwa, K. A., Horwitz, R., Lamers, M. L. Non-muscle myosin II in disease: mechanisms and therapeutic opportunities. Disease Models & Mechanisms. 8 (12), 1495-1515 (2015).
- He, Y. M., Gu, M. M. Research progress of myosin heavy chain genes in human genetic diseases. Yi Chuan. 39 (10), 877-887 (2017).
- Rauscher, A. A., Gyimesi, M., Kovacs, M., Malnasi-Csizmadia, A. Targeting Myosin by Blebbistatin Derivatives: Optimization and Pharmacological Potential. Trends in Biochemical Sciences. 43 (9), 700-713 (2018).
- Straight, A. F., et al. Dissecting temporal and spatial control of cytokinesis with a myosin II Inhibitor. Science. 299 (5613), 1743-1747 (2003).
- Sirigu, S., et al. Highly selective inhibition of myosin motors provides the basis of potential therapeutic application. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (47), E7448-E7455 (2016).
- Green, E. M., et al. A small-molecule inhibitor of sarcomere contractility suppresses hypertrophic cardiomyopathy in mice. Science. 351 (6273), 617-621 (2016).
- Morgan, B. P., et al. Discovery of omecamtiv mecarbil the first, selective, small molecule activator of cardiac Myosin. ACS Medicinal Chemistry Letters. 1 (9), 472-477 (2010).
- Kepiro, M., et al. para-Nitroblebbistatin, the non-cytotoxic and photostable myosin II inhibitor. Angewandte Chemie International Edition. 53 (31), 8211-8215 (2014).
- Varkuti, B. H., et al. A highly soluble, non-phototoxic, non-fluorescent blebbistatin derivative. Scientific Reports. 6, 26141 (2016).
- Verhasselt, S., et al. Discovery of (S)-3′-hydroxyblebbistatin and (S)-3′-aminoblebbistatin: polar myosin II inhibitors with superior research tool properties. Organic and Biomolecular Chemistry. 15 (9), 2104-2118 (2017).
- Verhasselt, S., Roman, B. I., Bracke, M. E., Stevens, C. V. Improved synthesis and comparative analysis of the tool properties of new and existing D-ring modified (S)-blebbistatin analogs. European Journal of Medicinal Chemistry. 136, 85-103 (2017).
- Warren, G. B., Toon, P. A., Birdsall, N. J., Lee, A. G., Metcalfe, J. C. Reconstitution of a calcium pump using defined membrane components. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (3), 622-626 (1974).
- Kiianitsa, K., Solinger, J. A., Heyer, W. D. Rad54 protein exerts diverse modes of ATPase activity on duplex DNA partially and fully covered with Rad51 protein. Journal of Biological Chemistry. 277 (48), 46205-46215 (2002).
- Hanzelmann, P., Schindelin, H. Structural Basis of ATP Hydrolysis and Intersubunit Signaling in the AAA+ ATPase p97. Structure. 24 (1), 127-139 (2016).
- Hackney, D. D., Jiang, W. Assays for kinesin microtubule-stimulated ATPase activity. Methods in Molecular Biology. 164, 65-71 (2001).
- Kiianitsa, K., Solinger, J. A., Heyer, W. D. NADH-coupled microplate photometric assay for kinetic studies of ATP-hydrolyzing enzymes with low and high specific activities. Analytical Biochemistry. 321 (2), 266-271 (2003).
- Carter, S. G., Karl, D. W. Inorganic phosphate assay with malachite green: an improvement and evaluation. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 7 (1), 7-13 (1982).
- Henkel, R. D., VandeBerg, J. L., Walsh, R. A. A microassay for ATPase. Analytical Biochemistry. 169 (2), 312-318 (1988).
- Rowlands, M. G., et al. High-throughput screening assay for inhibitors of heat-shock protein 90 ATPase activity. Analytical Biochemistry. 327 (2), 176-183 (2004).
- Rule, C. S., Patrick, M., Sandkvist, M. Measuring In Vitro ATPase Activity for Enzymatic Characterization. Journal of Visualized Experiments. (114), 54305 (2016).
- Pardee, J. D., Spudich, J. A. Purification of muscle actin. Methods in Cell Biology. 24, 271-289 (1982).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
- Kovacs, M., Toth, J., Hetenyi, C., Malnasi-Csizmadia, A., Sellers, J. R. Mechanism of blebbistatin inhibition of myosin II. Chem Journal of Biological Chemistry. 279 (34), 35557-35563 (2004).
- Allingham, J. S., Smith, R., Rayment, I. The structural basis of blebbistatin inhibition and specificity for myosin II. Nature Structural & Molecular Biology. 12 (4), 378-379 (2005).
- Kettlun, A. M., et al. Purification and Characterization of 2 Isoapyrases from Solanum-Tuberosum Var Ultimus. Phytochemistry. 31 (11), 3691-3696 (1992).
- Hulme, E. C., Trevethick, M. A. Ligand binding assays at equilibrium: validation and interpretation. British Journal of Pharmacology. 161 (6), 1219-1237 (2010).
- Motulsky, H. J., Neubig, R. R. Analyzing binding data. Current Protocols in Neuroscience. 52 (1), 7.5.1-7.5.65 (2010).
- Sehgal, P., Olesen, C., Moller, J. V. ATPase Activity Measurements by an Enzyme-Coupled Spectrophotometric Assay. Methods in Molecular Biology. 1377, 105-109 (2016).
- Solinger, J. A., Lutz, G., Sugiyama, T., Kowalczykowski, S. C., Heyer, W. D. Rad54 protein stimulates heteroduplex DNA formation in the synaptic phase of DNA strand exchange via specific interactions with the presynaptic Rad51 nucleoprotein filament. Journal of Molecular Biology. 307 (5), 1207-1221 (2001).
- Banik, U., Roy, S. A continuous fluorimetric assay for ATPase activity. Biochemistry Journal. 266 (2), 611-614 (1990).
- Xiao, Y. X., Yang, W. X. KIFC1: a promising chemotherapy target for cancer treatment?. Oncotarget. 7 (30), 48656-48670 (2016).
- See, S. K., et al. Cytoplasmic Dynein Antagonists with Improved Potency and Isoform Selectivity. ACS Chemical Biology. 11 (1), 53-60 (2016).
- Datta, A., Brosh, R. M. New Insights Into DNA Helicases as Druggable Targets for Cancer Therapy. Frontiers in Molecular Biosciences. 5, 59 (2018).
