Adattamento semi-alto/throughput del saggio ATPase accoppiato NADH per lo screening degli inibitori delle piccole molecole

I miosini sono trasduttori di energia meccanochimica che idrolizzano il tripfosfato di adenosina (ATP) per generare movimento direzionale lungo i filamenti del citoscheletro actinos in eucarioti^1,2. Si sono adattati sia strutturalmente che kineticamente alle loro varie funzioni intracellulari, come il trasporto di organelli, la contrazione muscolare o la generazione di tensione citoscheletrica^1,2. La superfamiglia della miosina è rappresentata da 40 geni della miosina appartenenti a classi di miosina distinte da 12 dollari nel genoma umano^3,4. I membri delle classi di miosina svolgono vari ruoli in una serie molto diversificata di disturbi, come diversi tumori, disturbi neurologici, miopatie scheletriche e cardiomiopatia ipertrofica^5,6. Dato il gran numero di funzioni fisiologiche e patologiche di questi motori molecolari, non è sorprendente che stiano diventando sempre più riconosciuti come bersagli farmacologici per una varietà di condizioni⁷. Recentemente sono stati compiuti progressi significativi nella scoperta di nuovi inibitori della miosina^8,9,10 e attivatori¹¹, e per migliorare le proprietà di quelli esistenti^{12, 13} del sistema ^{, 14} Del sistema ^{, 15}.

Il saggio ATPase (NADH) accoppiato alla nicotinammide adenina (NADH) è stato a lungo utilizzato per misurare l’attività ATPase di vari enzimi, come il reticulum sarccoplasmico Ca^2o pompa ATPase¹⁶, la riparazione del DNA ATPase Rad54¹⁷, l’AAA ATPase p97¹⁸ o il motore microtubulo kinesin¹⁹. Il saggio utilizza un ciclo di rigenerazione ATP. Il difosfato di adenosina (ADP) generato dall’ATPase viene rigenerato all’ATP dalla chinasi pirata (PK), che trasforma una molecola di fosforenolpyruvate (PEP) in pyruvate in parallelo. Successivamente, il pirate viene ridotto al lattato dalla dehydrogenasi lattato (LDH). Che, a sua volta, ossida una molecola di NADH a NAD. Pertanto, la diminuzione della concentrazione di NADH in funzione del tempo è uguale al tasso di idrolisi ATP. Il ciclo di rigenerazione ATP mantiene la concentrazione ATP quasi costante e la concentrazione di ADP bassa fino a quando è disponibile PEP. Questo si traduce in corsi di tempo lineari, rendendo semplice determinare i tassi di reazione iniziali e aiuta a evitare l’inibizione del prodotto da ADP¹⁹. Anche se il test ATPase accoppiato con NADH è già stato adattato ad un formato^a96 ben20, gli elevati volumi di reazione (150 dollari) lo rendono relativamente costoso a causa dell’elevata domanda di reagenti, rendendolo meno suscettibile di screening rapido di un gran numero di Composti. I metodi alternativi, come il test verde malessere^19,21, che si basa sulla rilevazione del fosfato prodotto dall’enzima ATPase, si sono dimostrati più adatti per la miniaturizzazione e lo screening ad alto valore^{22 , 23} del 23 o ^{, 24.}Tuttavia, è più probabile che un’espressione endpoint sia influenzata da diversi artefatti (discussi di seguito), che potrebbero rimanere sconosciuti in assenza di corsi a tempo pieno.

In questo caso, il saggio ATPase accoppiato nADH è stato ottimizzato per lo screening semi-alto della produttività degli inibitori delle piccole molecole. La miosina scheletrica e cardiaca muscolare miosina II e gli inibitori della miosina blebbistatin⁸, para-aminoblebbistatin¹³ e para-nitroblebbistatin¹² sono utilizzati per dimostrare la potenza del saggio, che si basa su NADH fluorescenza come una lettura. Questo protocollo è suscettibile di vagliare progetti incentrati su qualsiasi enzimi che producono ADP.