Eine semi-High-Throughput-Anpassung des NADH-gekoppelten ATPase-Assays zum Screening kleiner Molekülinhibitoren
Summary
Ein Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid (NADH)-gekoppelter ATPase-Assay wurde an das semihohe Durchsatzscreening von kleinen Molekül-Myosininhibitoren angepasst. Dieser kinetische Assay wird in einem 384-Well-Mikroplattenformat mit einem Gesamtreaktionsvolumen von nur 20 l pro Brunnen ausgeführt. Die Plattform sollte für praktisch jedes ADP-produzierende Enzym gelten.
Abstract
ATPase-Enzyme nutzen die in Adenosintriphosphat gespeicherte freie Energie, um eine Vielzahl von endergonischen biochemischen Prozessen in vivo zu katalysieren, die nicht spontan auftreten würden. Diese Proteine sind entscheidend für alle Aspekte des Zelllebens, einschließlich Stoffwechsel, Zellteilung, Reaktionen auf Umweltveränderungen und Bewegung. Das hier vorgestellte Protokoll beschreibt einen nicotinamidadenin-Dinukleotid (NADH)-gekoppelten ATPase-Assay, der an das semi-hohe Durchsatzscreening kleiner Molekül-ATPase-Inhibitoren angepasst wurde. Der Assay wurde als Beweis für das Prinzip auf Herz- und Skelettmuskel Myosin II, zwei aktinbasierte molekularmotorische ATPases, angewendet. Die Hydrolyse von ATP wird mit der Oxidation von NADH durch enzymatische Reaktionen im Assay gekoppelt. Zunächst wird die von der ATPase erzeugte ADP durch Pyruvatkinase (PK) zu ATP regeneriert. PK katalysiert den Übergang von Phosphoenolpyruvat (PEP) zu Pyruvat parallel. Anschließend wird Pyruvat durch Laktatdehydrogenase (LDH) zu Laktat reduziert, was die Oxidation von NADH parallel katalysiert. Somit steht die Abnahme der ATP-Konzentration in direktem Zusammenhang mit der Abnahme der NADH-Konzentration, gefolgt von einer Veränderung der intrinsischen Fluoreszenz von NADH. Solange PEP im Reaktionssystem verfügbar ist, bleibt die ADP-Konzentration sehr gering, wodurch eine Hemmung des ATPase-Enzyms durch sein eigenes Produkt vermieden wird. Darüber hinaus bleibt die ATP-Konzentration nahezu konstant, was zu linearen Zeitkursen führt. Die Fluoreszenz wird kontinuierlich überwacht, was eine einfache Abschätzung der Datenqualität ermöglicht und dabei hilft, potenzielle Artefakte herauszufiltern (z. B. durch zusammengesetzte Fällungen oder thermische Veränderungen).
Introduction
Myosine sind mechanochemische Energiewandler, die Adenosintriphosphat (ATP) hydrolysieren, um richtungsweisende Bewegungen entlang der Filamente des Aktin-Zytoskeletts in Eukaryoten1,2zu erzeugen. Sie haben sich sowohl strukturell als auch kinetisch an ihre verschiedenen intrazellulären Funktionen angepasst, wie z.B. den Transport von Organellen, Muskelkontraktion oder die Erzeugung von Zytoskelettspannung1,2. Die Myosin-Überfamilie wird durch 40 Myosin-Gene repräsentiert, die zu 12 verschiedenen Myosin-Klassen im menschlichen Genom3,4gehören. Mitglieder der Myosin-Klassen spielen verschiedene Rollen in einer sehr unterschiedlichen Reihe von Erkrankungen, wie mehrere Krebsarten, neurologische Störungen, Skelettmyopathien, und hypertrophe Kardiomyopathie5,6. Angesichts der großen Anzahl von physiologischen und pathologischen Funktionen dieser molekularen Motoren, ist es nicht verwunderlich, dass sie zunehmend als Wirkstoffziele für eine Vielzahl von Bedingungen erkannt werden7. Erhebliche Fortschritte wurden in letzter Zeit bei der Entdeckung neuer Myosininhibitoren8,9,10 und Aktivatoren11, und zur Verbesserung der Eigenschaften der bestehenden12 , 13 , 14 , 15.
Der nicotinamidadenin-Dinukleotid (NADH)-gekoppelte ATPase-Assay wird seit langem verwendet, um die ATPase-Aktivität verschiedener Enzyme zu messen, wie z.B. die sarkoplasmische Retikulum-Ca 2+-Pumpe ATPase16, die DNA-Reparatur ATPase Rad5417, die AAA+ ATPase p9718 oder der Mikrotubuli-Motor Kinesin19. Der Test verwendet einen ATP-Regenerationszyklus. Das von der ATPase erzeugte Adenosindiphosphat (ADP) wird durch Pyruvatkinase (PK) zu ATP regeneriert, wodurch ein Molekül Phosphoenolpyruvat (PEP) parallel in Pyruvat umwandelt. Anschließend wird Pyruvat durch Laktatdehydrogenase (LDH) zu Laktat reduziert. Das wiederum oxidiert ein Molekül von NADH zu NAD. Daher entspricht die Abnahme der NADH-Konzentration in Abhängigkeit von der Zeit der ATP-Hydrolyserate. Der ATP-Regenerationszyklus hält die ATP-Konzentration nahezu konstant und die ADP-Konzentration niedrig, solange PEP verfügbar ist. Dies führt zu linearen Zeitkursen, was es einfach macht, die anfänglichen Reaktionsraten zu bestimmen und hilft, Produkthemmung durch ADP19zu vermeiden. Obwohl der NADH-gekoppelte ATPase-Assay bereits an ein 96-Well-Format20angepasst wurde, machen die hohen Reaktionsvolumina (ca. 150 l) es aufgrund der hohen Nachfrage nach Reagenzien relativ teuer, so dass er weniger anfällig für eine schnelle Abschirmung großer Verbindungen. Alternative Methoden wie der Malachit-Grüntest19,21, der auf dem Nachweis des vom ATPase-Enzym produzierten Phosphats beruht, erwiesen sich als besser geeignet für die Miniaturisierung und das Hochdurchsatzscreening22 , 23 , 24. Ein Endpunkttest wird jedoch eher von mehreren Artefakten beeinflusst (siehe unten), die ohne Vollzeitkurse unentdeckt bleiben können.
Hier wurde der NADH-gekoppelte ATPase-Assay für das semi-hohe Durchsatzscreening kleiner Molekülinhibitoren optimiert. Skelett- und Herzmuskelmyosin II und die Myosininhibitoren Blebbistatin8, Para-Aminoblebbistatin13 und Para-Nitroblebbistatin12 werden verwendet, um die Kraft des Assays zu demonstrieren, der auf NADH beruht Fluoreszenz als Auslesung. Dieses Protokoll ist für Screening-Projekte zugänglich, die sich auf alle ADP-produzierenden Enzyme konzentrieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritische Schritte im Protokoll
Optimieren Sie das Plattenlayout, indem Sie mehrere Platten nur mit Negativkontrolle betreiben (ATPase-Reaktion ohne Inhibitor). Prüfen Sie die Ergebnisse sorgfältig auf Muster in Reaktionsgeschwindigkeiten. Diese können z. B. durch Kanteneffekte und/oder Unvollkommenheiten in der hydrophilen Oberflächenbeschichtung von “unverbindlichen” Platten entstehen. Wenn ein Muster beobachtet wird, ändern Sie den Plattentyp und/oder das Plattenlayout…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium des National Institute of Neurological Disorders and Stroke und des National Institute on Drug Abuse NS096833 (CAM) unterstützt.
Materials
| 384-well Low Flange Black Flat Bottom Polystyrene NBS Microplate | Corning | 3575 | |
| ATP (Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate) | Sigma | A7699 | |
| Aurora FRD-IB Dispenser | Aurora Discovery, Inc. | 00017425 | |
| Biomek NXP Multichannel Laboratory Automation Workstation | Beckman Coulter | A31841 | |
| Blebbistatin | AMRI | N/A | Custom synthesis |
| BSA (Bovine Serum Albumin, Protease-Free) | Akron Biotech | AK1391 | |
| Centrifuge 5430 R, refrigerated, with Rotor FA-35-6-30 | Eppendorf | 022620663 | |
| Centrifuge 5430, non-refrigerated, with Rotor A-2-MTP | Eppendorf | 022620568 | |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide) | Sigma | D2650 | |
| DTT (DL-Dithiothreitol) | Sigma | D5545 | |
| E1 ClipTip Multichannel Pipette; 384-format; 8-channel | Thermo Scientific | 4672010 | |
| E1 ClipTip Multichannel Pipette; 96-format; 8-channel | Thermo Scientific | 4672080 | |
| EGTA (Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid) | Sigma | E3889 | |
| EnVision 2104 Multilabel Plate Reader | PerkinElmer | 2104-0010 | |
| Glycerol | Sigma | G2025 | |
| LDH (L-Lactic Dehydrogenase from rabbit muscle) | Sigma | L1254 | |
| MgCl2.6H2O (Magnesium chloride hexahydrate) | Sigma | M2670 | |
| Microplate Shaker | VWR | 12620-926 | |
| Microplate, 384 well, PP, Small Volume, Deep Well, Natural | Greiner Bio-One | 784201 | |
| MOPS (3-(N-Morpholino)propanesulfonic acid) | Sigma | M1254 | |
| Myosin Motor Protein (full length) (Bovine cardiac muscle) | Cytoskeleton | MY03 | |
| Myosin Motor Protein (full length) (Rabbit skeletal muscle) | Cytoskeleton | MY02 | |
| NADH (β-Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced disodium salt hydrate) | Sigma | N8129 | |
| NaN3 (Sodium azide) | Sigma | 71289 | |
| NaOH (Sodium hydroxide) | Sigma | S8045 | |
| Optical Filter CFP 470/24nm (Emission) | PerkinElmer | 2100-5850 | Barcode 240 |
| Optical Filter Fura2 380/10nm (Excitation) | PerkinElmer | 2100-5390 | Barcode 112 |
| Optical Module: Beta Lactamase | PerkinElmer | 2100-4270 | Barcode 418 |
| OriginPro 2017 software | OriginLab | N/A | |
| para-Aminoblebbistatin | AMRI | N/A | Custom synthesis |
| para-Nitroblebbistatin | AMRI | N/A | Custom synthesis |
| PEP (Phospho(enol)pyruvic acid monopotassium salt) | Sigma | P7127 | |
| PK (Pyruvate Kinase from rabbit muscle) | Sigma | P9136 | |
| Rabbit Muscle Acetone Powder | Pel Freez Biologicals | 41995-2 |
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