一种直接而简单的方法，用于评估从胚胎到成人的果蝇黑色素的生存能力

该方法准确且可重复地允许一个人在结合到chi平方分析时，从胚胎到成年的存活性。 在初步研究中，在计算胚胎和幼虫后，葡萄琼脂被直立放置在小瓶的一侧。不幸的是，当琼脂被放置在小瓶的一侧时，许多胚胎和幼虫没有成熟成人。这可能是由于葡萄琼脂盘干燥（图3）。这种放置引入了一个环境变量（琼脂盘的水化），这可能会混淆结果。大约39%的后代在胚胎之间丢失到成人，因为只有61%的成年人出现。最大的损失发生在L1幼虫（在葡萄琼脂板表面计数）和pupae（在食物瓶壁上计数）之间。然而，当葡萄琼脂被放置在小瓶内直接接触食物表面时，不到6%的后代丢失（图2）。当整个葡萄琼脂盘与小瓶内的即时食物的水分接触时，琼脂保持水分（图7，图8）。这些结果表明，小瓶内琼脂的位置对于获得可靠的数据并尽量减少环境变量的贡献非常重要。通过比较初始方法验证中使用的野生型后代和通过跨越原始野生型雌性从平衡Dm ime4突变种群中生成的后代，收集了支持该方法有效性的进一步数据（补充图2 ，ime4_null/TM3sb）。大约91%的后代成熟到成年，而94%的后代来自野生型（图4）。 这种差异在统计上并不显著。 同源Dm ime4突变雄性5也被用来提供进一步的验证方法。然而，同源突变体病重，无法繁殖，在胚胎沉积前死亡。因此，实验的一个限制是，雄性需要足够健康才能繁殖，才能产生一个起始胚胎群来跟踪。 图 1：Dm ime4突变库存在低于孟德尔水平出现。显示催化域或 Ado-Met 绑定域部分发生突变的库存（详情请参阅补充图1）。一些股票有部分的两个域被阿拉（阿兰宁扫描诱变）取代，而其他股票已删除或两个域删除。观测到的同源数与预期数的比率以百分比表示（与杂性兄弟对照相比，请参阅补充图 3进行排序方案和 chi 平方分析）。执行 Chi 平方分析以确定观测到和预期之间的差异是否具有统计显著性，而不是仅由于偶然性（p 值 < 0.01）。误差条表示平均值的标准误差（每个指示的交叉至少三次试验）。 包含所有数据的电子表格可以在补充材料中找到。请点击此处查看此图的较大版本。 图 2：小瓶内的 Agar 位置可能会引入意外的环境变量。不同发育阶段个体数量的直方图从葡萄琼脂盘胚胎侧到食物小瓶或食物瓶侧面的琼脂中计数。将琼脂盘胚胎侧放在小瓶中，导致94%（SD = 0.02）的初始胚胎存活至成年。将琼脂放在食物瓶的一侧，只导致61%（SD = 0.07）的最初计数胚胎成年。包含所有数据的电子表格可以在补充材料中找到。每个阶段的预期数量被设置为在转移到食物小瓶之前在葡萄琼脂盘上计数的胚胎/L1的初始数量（空假说：100%的孵化胚胎发育）。观察到的数字是为所指明的发展阶段计算的实际人数。因此，每个阶段与葡萄琼脂板上的孵化胚胎的初始数量进行比较。执行 Chi 平方分析以确定观测到和预期之间的差异是否具有统计显著性，而不是由于使用 0.05 的 p 值阈值仅由于偶然性。对于在食物小瓶一侧用琼脂生长的胚胎，差异是显著的，但对于在盘内胚胎侧下生长的胚胎则不显著。误差条表示标准错误（每个指示的交叉至少三次试验）。请点击此处查看此图的较大版本。 图 3：卡通显示两种方式葡萄琼脂盘携带胚胎/L1可以放置在食物小瓶内。根据琼脂在食物小瓶中的位置，胚胎总数和成年后代之间存在显著差异。差异源于食物瓶内盘放置差异造成的环境变量（水化）：当琼脂计数时，幼虫和幼虫中的预期数和观测值之间存在统计显著性差异圆盘被放置在小瓶的一侧，在琼脂盘与食物接触时，预期数与观察到的数字没有显著差异。请点击此处查看此图的较大版本。 图 4：直方图显示从野生型雄性到Dm ime4突变平衡股的个体数量，从野生型雄性与雄性处于不同发展阶段。平衡雄叉到处女野生型雌性如 2 . 1 所述。 阿加被移植胚胎侧下到食物小瓶。 从野生X型野生型葡萄琼脂盘中从原始胚胎中产生的成年人的平均比率为94%，SD = 0.02，而Dm ime4突变/+ X野生型的平均比率为91%，SD = 0.01。如图2所示，进行了统计分析。差异对两个组都不显著。请点击此处查看此图的较大版本。 图 5：实验设置。（A） 胚胎收集迷你笼子和葡萄-琼脂迷你培养皿。板被放置在一个潮湿的室（标准培养皿与吸收纸盘饱和水）以防止脱水。 少量的酵母膏被放置在每个葡萄琼盘的中心。 （B） 取下胚胎收集板支架盖（红色），并放置一个准备好的板，酵母侧向上。 （C） 将十字架转移到胚胎笼中，并立即放置一个培养皿盖，将苍蝇放在里面。 （D） 快速取下盖子并翻转胚胎笼，以便打开接触葡萄琼脂板。 孵育24-48小时，每天检查。请点击此处查看此图的较大版本。 图 6：葡萄琼脂板上的胚胎发育。（A） 沉积在葡萄-琼脂小培养皿上的野生型胚胎在解剖显微镜下计数。在未可视化时，将板放在潮湿室内，避免直射光线，以防止脱水。 （B） 葡萄-琼脂板保存在潮湿的室内，并记录孵化的野生型胚胎。 这张照片显示了三个野生型L1幼虫，从A所示的胚胎中发展。 （C）图5所示的两个板块的胚胎（第1天）和L1幼虫（第2天）的记录数量的例子。 零假说的”预期数量”由在转移到食物小瓶时孵化并成为L1幼虫的胚胎数量决定（下表）。 对于野生型苍蝇，几乎所有的胚胎孵化和发育成L1幼虫。 这可能不是其他遗传背景的情况，这种方法用于确定这些差异的可行性。请点击此处查看此图的较大版本。 图 7：转移幼虫。 （A） 在记录L1计数后，使用干净的（乙醇擦拭）铲（B、C）小心地从培养皿中取出葡萄-琼脂盘，并向下转移L1，以接触小瓶中的食物，如D所示。 （E） 对空的培养皿进行仔细检查，以检测任何留下的幼虫。 如果留下的幼虫还活着，可以转移到食物小瓶，这样做仔细，并立即（F）。 如果留下的幼虫已经死亡或无法转移，请记录这一事实，以更正后续计算的”预期数量”。请点击此处查看此图的较大版本。 图 8：L2幼虫进入食物。看到葡萄-琼脂盘和蓝色食物之间的缝隙和凹槽。 设定一个时间表，每天观察小瓶，最好是在一天中的同一时间。请点击此处查看此图的较大版本。 图 9：成人出现。（A） L3幼虫从食物中出来，变成幼虫. （B） 成人从第11天开始出现. 设定一个时间表，每天观察小瓶，最好是在一天中的同一时间，并仔细记录您的观察。 停止计数时，所有的pupae出现（计数空的pupae案件），并避免计数的下一代苍蝇停止实验在第15天，并计数死pupae（黑色/干pupae）。 生命周期较长的突变体可能需要较长的时间，这需要根据经验来确定。请点击此处查看此图的较大版本。 补充数字。请点击此处下载这些文件。   补充材料。请点击此处下载这些文件。