Virüs subtypes arasında serum antikorların genişliğini ölçmek için bir Influenza antijen microarray kullanımı
Summary
Biz farklı virüs suşları 250 üzerinde antijenler karşı birden fazla antikor izotürler için aynı anda prob serum nitroselüloz kaplı slaytlar üzerine baskı grip antijenleri tarafından inşa edilen bir protein mikroarray kullanmak için bir protokol sunuyoruz, böylece virüs alt türleri arasında serum antikorları genişliği ölçümü izin.
Abstract
Grip virüsü, şu anda mevcut aşıların sınırlı etkinliğini nedeniyle Dünya çapında önemli bir mortalite nedeni olarak kalır. Evrensel grip aşıları gelişimine önemli bir zorluk antijenik drift kaynaklanan yüksek antijenik çeşitlilik. Bu zorluk üstesinden farklı antijenik alt türleri arasında birçok virüs suşları karşı yönlendirilmiş serum antikorların genişliğini ölçmek için yeni araştırma araçları gerektirir. Burada, çeşitli grip virüsü suşları karşı serum antikorlarının kapsamını analiz etmek için bir protokol sunar, bir protein mikrodizi grip antijenleri kullanarak.
Bu grip antijen mikrodizisi, Mikroarray yazıcı kullanılarak arıtılmış hemagglutinin ve nöraminidaz antijenleri nitroselüloz kaplı bir membran üzerine yazdırarak inşa edilir. İnsan serumu, grip antijenlerine karşı antikorları bağlamak için Mikroarray üzerinde inkübe edilir. Quantum-dot-konjuge ikincil antikorlar aynı anda microarray üzerinde her antijeni bağlayan IgG ve IgA antikorları algılamak için kullanılır. Nicel antikor bağlama, taşınabilir bir görüntü kullanarak floresan yoğunluğu olarak ölçülür. Temsili sonuçlar, insan serumunda alt türe özel ve çapraz reaktif grip antikorlarının ölçümünde tahlil yeniden üretilebilirliği göstermek için gösterilir.
ELISA gibi geleneksel yöntemlerle karşılaştırıldığında, grip antijen mikrodizisi, kısa zaman diliminde yüzlerce antijene karşı birden fazla antikor izottipi için yüzlerce sera testi yapabilen yüksek verimlilik sağlayan çok yönlü bir yaklaşım sağlar ve böylece sero-gözetim ve aşı geliştirme uygulamaları. Bir sınırlama, bağlayıcı antikorların nötralize antikorları ayırt etmek için yetersizlik olduğunu.
Introduction
Grip virüsü, her yıl dünya çapındaki tüm ölümlerin% 1 ‘ini, tropik bölgelerde yaşlı ve nüfus üzerindeki orantısız etkileri ve gelişmekte olan dünya1‘ i içeren ölüm veya özürlülüğe göre yıllık 20.000.000 yaşam yılı kaybına karşı sorumludur. 2,3. Mevsimlik salgın hastalıkların yükünü ek olarak, yeni grip suşlarının genetik yeniden çeşitlendirme yoluyla ortaya çıkması ya doğal olarak ortak konaklarda ya da yapay olarak biyoterörizm için dünya çapında pandemiler Hızlı Spread ve yüksek darlık yol açabilir 4 , 5. süre sayısız grip aşıları Şu anda mevcut, onların etkinliğini alt özgüllüğü ile sınırlıdır6, çoklu virüs karşı uzun ömürlü bağışıklık görüşmek evrensel grip aşıları geliştirmek için ihtiyaç oluşturma suşları7.
Evrensel grip aşıları gelişimi için önemli bir zorluk suşları arasında yüksek antijenik çeşitlilik. Dolaşım virüslerinin antijenik varyasyonu ile birlikte mevcut aşıların antijenik özgüllüğü aşı suşları ve sirkülasyon suşları arasında bir uyuşmazlık oluşturur. Bu, bir salgın sırasında aşı suşları uzak daha fazla genetik drift lehine bir evrimsel avantajı confers, aşı etkinliğini genellikle az 50%8,9sınırlandırmak. Antijenik uyuşmazlığın ek bir kaynağı, aşı üretimi sırasında oluşturulan yumurta adaptif viral mutasyonlardır ve bu da virüslerin10,11.
Yüksek antijenik çeşitlilik bu zorluk üstesinden yeni araştırma araçları serum ve mukozal örneklerinde klinik olarak ilgili antijenik türevleri arasında önceden mevcut ve elicited immün tepkiler genişliğini karakterize gerektirir. Hemaglütinasyon inhibisyonu (HAI), microneutralization (MN) ve geleneksel ELISA dahil olmak üzere şu anda mevcut yöntemler, bir defada tek bir virüs gerileme karşı antikorları tespit sınırlıdır, bu yüzden birden fazla antikor izotypes tespiti için kullanımı birden fazla virüs suşları hızlı bir şekilde mevcut klinik numune ve laboratuar kaynaklarını tükenme karşı. Ayrıca, HAı ve MN sadece özel laboratuvarlarda kullanılabilir canlı virüs kültürü gerektirir.
Şekil 1‘ de gösterildiği gibi nitroselüloz kaplı slaytlara basılmış binlerce antijenden oluşan protein mikrodizileri, bu gereksinimi12‘ ye doldurabilir. Bu mikrodiziler, dizi üzerindeki her bir antijen karşı nicel antikor izottibi/alt tip düzeylerini belirlemek için küçük miktarlarda klinik numuneyi tüketirken yüksek verimlilik olarak üretilen ve probed edilebilir. Antijen keşfi için bu yaklaşım, birden fazla bulaşıcı patojenlere karşı tanı ve aşı gelişimine uygulanmıştır13. Bugüne kadar, 60.000 toplam ifade proteinleri dahil 35 üzerinde patojenler için protein mikrodiziler üretti ve virüslü ve kontrol bireylerinden 30.000 insan serası üzerinde araştırma yapmak için bunları kullandı. Mikroarray slaytlar için son zamanlarda geliştirilen taşınabilir görüntüleme platformu Bu metodoloji Son Kullanıcı14daha erişilebilir hale gelmiştir.
15, 16,17,18,19, bir grip protein mikroarray alanında birden fazla katkı tarafından kapsamlı bir önceki çalışma üzerine bina son zamanlarda üzerinde içeren geliştirilmiştir 250 saf hemagglutinin (ha) antijenik türevleri tüm 18 alt türlerinin temsili ile12,20. Bu metodolojisi kullanarak, doğal bir grip enfeksiyonu, filenetik olarak ilgili ha alt türlerine karşı geniş reaktif IgG ve IgA antikorları oluşturmak için gösterildi, bir intramusküler grip aşısı sadece Subtype özgü IgG üretirken antikorlar21. Ancak, grip aşıları için Toll-benzeri reseptörleri aktive bir adjuvan ekleyerek hayvan çalışmaları22‘ de ha alt türleri arasında elicited IgG antikor tepkisi genişletmek için gösterildi.
Bu mikrodizi Şu anda grip enfeksiyonu için takip edilen kolej öğrencilerinin prospektif kohort çalışmasında toplanan sera prob için kullanılmaktadır. Burada, bu çalışmada numunelerin bir alt kümesindeki alt tip ve çapraz-reaktif antikorları algılamak için assay tekrarlanabilirlik gösterimi ile grip antijen mikrodizinin metodolojisi bildirilmiştir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada açıklanan grip antijen mikro dizi Protokolü birçok antijenlere antikor yanıtlarını analiz gerektiren herhangi bir projeye uyarlanabilir. Mikrodizi platformu, daha önce12‘ de açıklanan şekilde veya arıtma olmadan 0,1 mg/ml veya daha yüksek verim elde edebilir herhangi bir sistemde ifade edilen herhangi bir protein antijen kümesi ile kullanılabilir. Eğer non-saf protein antijenleri (örneğin, in vitro transkripsiyon ve çeviri sistemi) doğrudan mikrodiziler yazdırmak için kullanılır, protein ifade sisteminin bileşenleri (örn., e. coli lysate) eklenmesi gerekir 1:10 engelleme için kullanılan tampon Bu bileşenlere yönelik herhangi bir antikorun engellenmesini sağlamak için sera ve kalite kontrol antikorlarının seyreltilmesi. Slayt yapılandırmaları, dizi başına daha yüksek sayıda antijen yerleştirmek için her slayda daha düşük sayıda daha büyük pedlerle kullanılabilir. Bu çalışmada, biz bir genemachines OmniGrid 100 Mikroarray Yazıcı doğrudan dizi üzerinde lekeler mevduat nitroselüloz yüzeyi temas iğne kullanır kullandık. Bu mikro dizi yazıcı artık ticari olarak kullanılabilir durumdayken, ticari olarak kullanılabilen diğer mikro dizi yazıcılar Bu protokolde kullanılabilir ancak özel pin (temas veya temas dışı) ve yazılım gerektirebilir ve yeterli spot çözünürlüğe sahip olmalıdır ve slayt ve Görüntüleyici ile uyumluluk. Sera reaktivitesine bağlı olarak, 1:50 ila 1:400 arasında dilüsyonlar kullanılabilir. Serum içermeyen tampon negatif kontrol olarak kullanılabilir, antijen bağlamak için bilinen monoklonal antikorlar olumlu bir kontrol olarak kullanılabilir.
Kullanıcılar birkaç sorun giderme sorunlarının farkında olmalıdır. Onun etiketi için antikorlar kullanarak kalite kontrol kontrol amacı baskı başarılı değildi herhangi bir antijenler kontrol etmektir. Sürekli olarak düşük sinyal kalite kontrol kontrol birden çok dizi büyük olasılıkla vermek herhangi bir nokta yetersiz antijen yazdırılan temsil eder. Olası nedenler arasında toplama veya yağış veya antijen kaynak plaka veya düşük temas baskı pin ve Mikroarray slayt arasında değişken kalınlık nedeniyle nitroselüloz Pad. Bu noktada, biz test normalleştirme kalite kontrol kontrol kantitatif sonuçlara dayalı gerçekleştirmeyin, Anti-onun antikorların tespit bağlayıcı bu etiketin kullanılabilirliği tarafından etkilenebilir verilen, hangi 3 boyutlu konformasyona bağlıdır Her antijen için özeldir.
Grip antijen mikrodizisi, ELISA gibi geleneksel yöntemlerin üzerinde çeşitli avantajlar sağlar ve HAI ve mn gibi fonksiyonel nitelikteki işlevlere tamamlayıcı niteliktedir. 16-Pad protein mikroarray, 1 μL serumdan yaklaşık 300 antijenlere karşı aynı anda birden fazla izotipteki antikorları ölçmek için kapasite ile örnek koruyucu bir teknolojidir. Antijenlerin sayısı, slaytlar başına pedlerin sayısını azaltarak binlerce kişi tarafından artırılabilir. Multiplexed assay de personel zaman ve sarf kaynakları yedek, sera yüzlerce antikorlar için probed olabilir verilen 2 gün, ve slaytlar ve reaktifler dışında tüm materyaller yeniden kullanılabilir böylece plastik atık büyük miktarlarda üretmeyin.
Mikroarray yazıcılar yaygın olarak dağıtılamayabilir, Mikroarray slaytlar merkezi bir konumda yazdırılabilir ve sonra yoklama için son kullanıcıya taşınır. Yoklama için gerekli tek ekipman düşük maliyetli ve taşınabilir Görüntüleyici. Bu protokol yaygınlaştırılması amacı bu tekniğin kullanımı daha yaygın hale getirmek için.
Grip antijen mikrodizinin ana sınırlamaları, algılanan antikorların fonksiyonunu ve kinetiği karakterize edeememesidir. Mikrodizi, her antijen için bir poliklonal bağlayıcı antikorlar kümesi algılıyor. Bu antikorlar HAI ve MN assays içinde nötralize virüs işlevsel olmayabilir veya olabilir. Ancak, HaI ve mn testlerde influenza kuş alt türlerine karşı antikorlar için test etmek için yüksek seviyeli Biyogüvenlik dolapları ile özel tesisler için ilişkili ihtiyaç ile canlı virüs kültürü gerektirir, protein mikroarray canlı virüs içermez ise Böylece herhangi bir temel laboratuvarda kullanılabilir. Bağlayıcı kinetik ile ilgili olarak, her antijen tek bir konsantrasyon içeren bir dizi ile probed serum tek bir seyreltme antijen bağlamak tüm antikorlar üzerinde toplanan miktar ve benzeşimi bileşik temsil eden tek bir veri noktası verir . Antijen-antikor bağlama kinetiği tam olarak çözmek için, birden fazla antijen konsantrasyonları ve/veya seraların seri dilleri gereklidir.
Bu sınırlamalara rağmen, grip antijen mikrodizisi, verimlilik ve kullanılabilirlik içinde daha sınırlı olan fonksiyonel niteliklerini tamamlayabilir antijenik peyzaj genelinde grip antikorların genişliğini karakterize etmek için yararlı bir araçtır.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar University of Maryland ıRB Protokolü altında insan sera toplamak için Prof Don Milton (Enstitü uygulamalı kamu sağlığı, Maryland Üniversitesi, College Park, MD, ABD) kabul etmek istiyorum #313842 DARPA N66001-18-2-4015 P00001 tarafından finanse edilir. Yazarlar ayrıca odni ıerpa DJF-15-1200-K-0001725 tarafından finanse edilen trimerized ha ve na antijenleri sağlamak için Prof. Florian kraymer (Icahn Medicine, mt. Sinai, NY, ABD) kabul etmek istiyorum. S. Khan kısmen ulusal araştırma kaynakları merkezi ve translasyonel Bilimler, Ulusal Sağlık Enstitüleri, Grant KL2 TR001416 aracılığıyla Ulusal Merkezi tarafından desteklenir. İçerik sadece yazarlar sorumluluğundadır ve mutlaka NıH resmi görüşlerini temsil etmez.
Materials
| 16-pad nitrocellulose-coated glass slides | Grace Bio Labs | 305016 | |
| 1x GVS FAST blocking buffer | Fischer Scientific | 10485356 | |
| ArrayCam portable imager | Grace Bio Labs | 400S | Other imaging devices can be used to visualize slides if capable of achieving the resolution of the microarray spots and the excitation and emission wavelengths of the quantum dots. |
| Biotin-conjugated goat anti-mouse-IgG antibody | Thermo Fischer | 31800 | |
| HiBase 384-well plate | Greiner Bio-One | T-3037-11 | |
| Microarray pins | ArrayIt | GMP2 | Each different microarray printer may require its own custom microarray pins. |
| Mouse monoclonal poly-His antibody | Sigma-Aldrich | H1029 | |
| OmniGrid 100 microarray printer | GeneMachines | The version of the microarray printer used in this work is no longer commercially available, but the updated similar equipment is the OmniGrid Accent microarray printer from Digilab (Hopkinton, MA), and the same protocol can be carried out with most commercially available microarray printers. | |
| ProPlate slide chambers | Grace Bio Labs | 246890 | |
| ProPlate slide clips | Grace Bio Labs | 204838 | |
| ProPlate slide frames | Grace Bio Labs | 246879 | |
| Quantum dot 585 nm conjugated goat anti-human-IgA antibody | Grace Bio Labs | 110620 | |
| Quantum dot 585 nm streptavidin conjugate | Thermo Fischer | Q10111MP | |
| Quantum dot 800 nm conjugated goat anti-human-IgG antibody | Grace Bio Labs | 110610 |
References
- Murray, C. J., et al. Disability-adjusted life years (DALYs) for 291 diseases and injuries in 21 regions, 1990-2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study. Lancet. 380 (9859), 2197-2223 (2010).
- Renegar, K. B., Crouse, D., Floyd, R. A., Krueger, J. Progression of influenza viral infection through the murine respiratory tract: the protective role of sleep deprivation. Sleep. 23 (7), 859-863 (2000).
- Li, L., et al. Heterogeneity in Estimates of the Impact of Influenza on Population Mortality: A Systematic Review. American Journal of Epidemiology. 187 (2), 378-388 (2018).
- Fauci, A. S. Seasonal and pandemic influenza preparedness: science and countermeasures. Journal of Infectious Diseases. 194 Suppl 2, S73-S76 (2006).
- Duggal, A., Pinto, R., Rubenfeld, G., Fowler, R. A. Global Variability in Reported Mortality for Critical Illness during the 2009-10 Influenza A(H1N1) Pandemic: A Systematic Review and Meta-Regression to Guide Reporting of Outcomes during Disease Outbreaks. PLoS One. 11 (5), 2009-2010 (2016).
- Demicheli, V., Jefferson, T., Ferroni, E., Rivetti, A., Di Pietrantonj, C. Vaccines for preventing influenza in healthy adults. Cochrane Database Systematic Reviews. 2, CD001269 (2018).
- Erbelding, E. J., et al. A Universal Influenza Vaccine: The Strategic Plan for the National Institute of Allergy and Infectious Diseases. Journal of Infectious Diseases. , (2018).
- Xie, H., et al. H3N2 Mismatch of 2014-15 Northern Hemisphere Influenza Vaccines and Head-to-head Comparison between Human and Ferret Antisera derived Antigenic Maps. Scientific Reports. 5, 15279 (2015).
- Tricco, A. C., et al. Comparing influenza vaccine efficacy against mismatched and matched strains: a systematic review and meta-analysis. BMC Medicine. 11, 153 (2013).
- Katz, J. M., Webster, R. G. Efficacy of inactivated influenza A virus (H3N2) vaccines grown in mammalian cells or embryonated eggs. Journal of Infectious Disease. 160 (2), 191-198 (1989).
- Zost, S. J., et al. Contemporary H3N2 influenza viruses have a glycosylation site that alters binding of antibodies elicited by egg-adapted vaccine strains. Proceedings of the National Academy of Science. 114 (47), 12578-12583 (2017).
- Davies, D. H., et al. Profiling the humoral immune response to infection by using proteome microarrays: high-throughput vaccine and diagnostic antigen discovery. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 102 (3), 547-552 (2005).
- Liang, L., Felgner, P. L. A systems biology approach for diagnostic and vaccine antigen discovery in tropical infectious diseases. Current Opinion in Infectious Diseases. 28 (5), 438-445 (2015).
- Jain, A., et al. Evaluation of quantum dot immunofluorescence and a digital CMOS imaging system as an alternative to conventional organic fluorescence dyes and laser scanning for quantifying protein microarrays. Proteomics. 16 (8), 1271-1279 (2016).
- Desbien, A. L., et al. Development of a high density hemagglutinin protein microarray to determine the breadth of influenza antibody responses. Biotechniques. 54 (6), 345-348 (2013).
- Mace, C. R., et al. Label-free, arrayed sensing of immune response to influenza antigens. Talanta. 83 (3), 1000-1005 (2011).
- Koopmans, M., et al. Profiling of humoral immune responses to influenza viruses by using protein microarray. Clinical and Microbiology Infections. 18 (8), 797-807 (2012).
- Bucukovski, J., Latorre-Margalef, N., Stallknecht, D. E., Miller, B. L. A Multiplex Label-Free Approach to Avian Influenza Surveillance and Serology. PLoS One. 10 (8), e0134484 (2015).
- Meade, P., Latorre-Margalef, N., Stallknecht, D. E., Krammer, F. Development of an influenza virus protein microarray to measure the humoral response to influenza virus infection in mallards. Emerging Microbes and Infection. 6 (12), e110 (2017).
- Vigil, A., Davies, D. H., Felgner, P. L. Defining the humoral immune response to infectious agents using high-density protein microarrays. Future Microbiology. 5 (2), 241-251 (2010).
- Nakajima, R., et al. Protein Microarray Analysis of the Specificity and Cross-Reactivity of Influenza Virus Hemagglutinin-Specific Antibodies. mSphere. 3 (6), (2018).
- Van Hoeven, N., et al. A Formulated TLR7/8 Agonist is a Flexible, Highly Potent and Effective Adjuvant for Pandemic Influenza Vaccines. Scientific Reports. 7, 46426 (2017).
- Krammer, F., et al. A carboxy-terminal trimerization domain stabilizes conformational epitopes on the stalk domain of soluble recombinant hemagglutinin substrates. PLoS One. 7 (8), e43603 (2012).
