العزلة ، الانتقال ، وثقافة الخلايا البشرية الاوليه
Summary
المعروض هنا هو بروتوكول الأمثل لعزل ، والزراعة ، ونقل ، والتفريق بين الخلايا الاساسيه البشرية من الافراد المصابين بالفيروس والضوابط الصحية.
Abstract
ولا يزال فيروس نقص المناعة البشرية أحد الشواغل الصحية الرئيسية علي الرغم من إدخال العلاج المضاد للفيروسات العكوسه في منتصف التسعينيات من القرن العشرين. في حين ان العلاج المضاد للفيروسات الرجعية يخفض بكفاءة الحمل الفيروسي الجهازي ويستعيد العد الطبيعي للخلاياالتائية ، فانه لا يعيد تشكيل جهاز مناعي وظيفي تماما. يمكن ان يتميز جهاز المناعة المختل في الافراد المصابين بفيروس نقص المناعة الذين يخضعون لعربه التسوق بالتنشيط المناعي ، والشيخوخة المبكرة للخلايا المناعية ، أو التهاب المستمر. وتضيف هذه الشروط ، إلى جانب العوامل المصاحبة للاصابه بالفيروس ، تعقيدا إلى المرض ، الذي لا يمكن استنساخه بسهوله في النماذج الخلوية والحيوانية. للتحقيق في الاحداث الجزيئية الكامنة وراء الخلل المناعي في هؤلاء المرضي ، يتم عرض نظام للثقافة والتلاعب بالخلايا الوحيدة الاساسيه البشرية في المختبر هنا. وعلي وجه التحديد ، يسمح البروتوكول للثقافة والانتقال من CD14 الابتدائية + مونوسيدات التي تم الحصول عليها من الافراد المصابين بفيروس نقص المناعة المكتسب الذين يخضعون لعربه التسوق وكذلك من الضوابط السلبية لفيروس نقص المناعة المكتسب. وتشمل هذه الطريقة العزلة والثقافة والانتقال من الخلايا الاحاديه والضامة المشتقة من البويضات. في حين يتم استخدام مجموعات المتاحة تجاريا والكواشف, البروتوكول يوفر نصائح هامه والظروف المثلي للانضمام الناجحة والانتقال من الخلايا الاحاديه مع محاكاة ميرنا ومثبطات وكذلك مع siRNAs.
Introduction
تسبب عدوي فيروس نقص المناعة البشرية-1 (HIV-1) خللا مناعيا شديدا ، وهو ما يمكن ان يؤدي إلى الاصابه بالعدوى الانتهازية ومتلازمة عوز المناعة المكتسب (الإيدز). علي الرغم من ان المرضي المصابين بفيروس نقص المناعة التي تمر بالعربة تتميز الأحمال الفيروسية المنخفضة والعد العادية الخلايا التائية + T ، ويمكن المساس بأداء الجهاز المناعي في هؤلاء الافراد ، مما يؤدي إلى استجابه مناعية مختلة التي ارتبطت بزيادة خطر الاصابه بالسرطان1 أليات الخلل المناعي في مرضي فيروس نقص المناعة الذاتية علي السلة لا تزال غير معروفه إلى حد كبير. ولذلك ، فان توصيف الخلايا المناعية المستمدة من المريض والتحقيق في علم الاحياء والوظيفة عنصر حاسم في البحوث الحالية بفيروس نقص المناعة المكتسب.
الخلايا الاحاديه والضامة هي المنظمين الرئيسيين للاستجابات المناعية وتلعب أدوارا أساسيه في الاصابه بفيروس نقص المناعة الذاتية2,3,4,5. غير متجانسة والبلاستيك في الطبيعة ، ويمكن تصنيف الضامة علي نطاق واسع في تنشيط كلاسيكي (M1) أو بدلا من ذلك تنشيط (M2). في حين ان هذا التصنيف العام ضروري عند اعداد الشروط التجريبية ، قد يتم عكس حاله الاستقطاب من الضامة من قبل مجموعه متنوعة من السايتوكينات6،7،8،9. علي الرغم من ان العديد من الدراسات قد حققت في اثار الاصابه بفيروس نقص المناعة الذاتية علي الخلايا الاحاديه والجذعية ، والتفاصيل الجزيئية للاستجابات بوساطة البويضات غير معروفه إلى حد كبير6،7،10،11،12،13،14،15،16،17،18،19 من بين العوامل التي تنطوي عليها تنظيم الخلايا المناعية ووظيفتها ، ميكرورناس (miRNAs) ، قصيرة غير الترميز RNAs ان ما بعد الهيستونات تنظيم التعبير الجيني ، وقد ثبت ان تلعب دورا هاما في سياق المسارات الخلوية الرئيسية (اي النمو ، والتمايز ، والتنمية ، والمبرمج)20. وقد وصفت هذه الجزيئات بأنها منظمات هامه من عوامل النسخ الاساسيه لإملاء الاستقطاب وظيفية من الضامة21. وقد تم التحقيق في الدور المحتمل لmirnas في الخلايا الاحاديه من الافراد المصابين بفيروس نقص المناعة الذين يخضعون لعربه التسوق ، ولكن التقدم في هذا المجال يتطلب المزيد من العمل22،23،24،25،26. تناقش هذه الورقة طريقه محسنه لتحويل miRNAs و siRNAs إلى خلايا بشريه أساسيه من المرضي المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية والضوابط.
يعتمد هذا البروتوكول علي الكواشف ومجموعات المواد المتاحة تجاريا ، لان الاستمرارية في الإجراءات التقنية تساعد علي أزاله المتغيرات التجريبية غير الضرورية عند العمل مع العينات السريرية. ومع ذلك ، فان الطريقة توفر نصائح هامه (اي عدد الخلايا المطلية أو الحاضنة القصيرة مع وسائل الاعلام الخالية من المصل لتعزيز التصاق الخلايا بالصفيحة). الاضافه إلى ذلك ، فان شروط الاستقطاب المستخدمة في هذا البروتوكول مستمده من الاعمال المنشورة27و28و29.
Protocol
Representative Results
Discussion
ويبين البروتوكول المعروض استخدام الخلايا الاوليه من الأشخاص المصابين بفيروس نقص المناعة الذاتية كنموذج لدراسة البويضات والضامات. فيروس نقص المناعة الذاتية + المرضي الذين يخضعون لعربه العيش مع العدوى لسنوات متعددة ، ويمكن أيضا ان يكون لها آخر العدوى المشتركة ذات الصلة جهاز المناعة…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويود المؤلفون ان يشكروا فيروس نقص المناعة البيولوجية/الأورام الحيوية النواة لتوفير عينات المريض والنواة الأيض المناعة الخلوية لتوفير تحليل تدفق الخلوي. تم تمويل هذا المشروع من قبل المعاهد القومية للصحة P20GM121288 و P30GM114732.
Materials
| 0.5M EDTA | Invitrogen | AM9260G | |
| BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with K2EDTA | BD Biosciences | 366643 | |
| Brilliant Stain Buffer | BD Horizon | 563794 | Flow cytometry |
| CD14 PerCP | Invitrogen | 46-0149-42 | Flow cytometry- conjugated antibody |
| CD163 BV711 | BD Horizon | 563889 | Flow cytometry- conjugated antibody |
| CD209 BV421 | BD Horizon | 564127 | Flow cytometry- conjugated antibody |
| CD80 FITC | BD Horizon | 557226 | Flow cytometry- conjugated antibody |
| CD83 APC | BD Horizon | 551073 | Flow cytometry- conjugated antibody |
| Easy 50 EasySep Magnet | StemCell Technologies | 18002 | |
| Easy Sep Direct Human Monocyte Isolation Kit | StemCell Technologies | 19669 | |
| EIF4EBP1 mAb | Cell Signaling | 9644 | Monoclonal antibody for Western blot |
| EIF4EBP1 siRNA | Santa Cruz | sc-29594 | |
| Fetal Bovin Serum Defined Heat Inactivated | Hyclone | SH30070.03HI | |
| Gallios Flow Cytometer | Beckman Coulter | B43618 | |
| GAPDH mAb | Santa Cruz | SC-47724 | Monoclonal antibody for Western blot |
| HuFcR Binding Inhibitor | eBiosciences | 14-9161-73 | Flow cytometry- blocking buffer |
| Kaluza Analysis Software | Beckman Coulter | B16406 | Software to analyze flow cytometry data |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli O55:B5 | Sigma | L4524 | |
| miRCURY LNA microRNA Mimic hsa-miR-146a-5p | Qiagen | YM00472124 | |
| MISSION miRNA Negative Control | Sigma | HMC0002 | Scrambled miRNA conjugated with a near infrared dye |
| Nunc 35mm Cell Culture Dish | Thermo Scientific | 150318 | |
| PBS | Gibco | 20012027 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Recombinant Human GM-CSF | R&D Systems | 215-GM-050 | |
| Recombinant Human IFN-γ | R&D Systems | 285-IF-100 | |
| Recombinant Human IL-4 | R&D Systems | 204-IL-010 | |
| Recombinant Human M-CSF | R&D Systems | 216-MC-025 | |
| RPMI 1640 with L-Glutamine | Corning | 10040CVMP | |
| Scrambled Control siRNA | Santa Cruz | sc-37007 | |
| Viromer Blue Transfection Reagent Kit | Lipocalyx | VB-01LB-01 | |
| WST-1 Cell Proliferation Reagent | Roche | 5015944001 | Colorimetric assay to assess cell viability |
References
- Slim, J., Saling, C. F. A Review of Management of Inflammation in the HIV Population. Biomedical Research International. 2016, 3420638 (2016).
- Herskovitz, J., Gendelman, H. E. HIV and the Macrophage: From Cell Reservoirs to Drug Delivery to Viral Eradication. Journal of Neuroimmune Pharmacology. 14 (1), 52-67 (2019).
- Machado Andrade, V., Stevenson, M. Host and Viral Factors Influencing Interplay between the Macrophage and HIV-1. Journal of Neuroimmune Pharmacology. 14 (1), 33-43 (2019).
- Merino, K. M., Allers, C., Didier, E. S., Kuroda, M. J. Role of Monocyte/Macrophages during HIV/SIV Infection in Adult and Pediatric Acquired Immune Deficiency Syndrome. Frontiers in Immunology. 8, 1693 (2017).
- Wacleche, V. S., Tremblay, C. L., Routy, J. P., Ancuta, P. The Biology of Monocytes and Dendritic Cells: Contribution to HIV Pathogenesis. Viruses. 10 (2), (2018).
- Davis, M. J., et al. Macrophage M1/M2 polarization dynamically adapts to changes in cytokine microenvironments in Cryptococcus neoformans infection. MBio. 4 (3), e00264 (2013).
- Raggi, F., et al. Regulation of Human Macrophage M1-M2 Polarization Balance by Hypoxia and the Triggering Receptor Expressed on Myeloid Cells-1. Frontiers in Immunology. 8, 1097 (2017).
- Van Overmeire, E., et al. M-CSF and GM-CSF Receptor Signaling Differentially Regulate Monocyte Maturation and Macrophage Polarization in the Tumor Microenvironment. 癌症研究. 76 (1), 35-42 (2016).
- Vogel, D. Y., et al. Human macrophage polarization in vitro: maturation and activation methods compared. Immunobiology. 219 (9), 695-703 (2014).
- Almeida, M., Cordero, M., Almeida, J., Orfao, A. Different subsets of peripheral blood dendritic cells show distinct phenotypic and functional abnormalities in HIV-1 infection. AIDS. 19 (3), 261-271 (2005).
- Ciesek, S., et al. Impaired TRAIL-dependent cytotoxicity of CD1c-positive dendritic cells in chronic hepatitis C virus infection. Journal of Viral Hepatitis. 15 (3), 200-211 (2008).
- Granelli-Piperno, A., Golebiowska, A., Trumpfheller, C., Siegal, F. P., Steinman, R. M. HIV-1-infected monocyte-derived dendritic cells do not undergo maturation but can elicit IL-10 production and T cell regulation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (20), 7669-7674 (2004).
- Hearps, A. C., et al. HIV infection induces age-related changes to monocytes and innate immune activation in young men that persist despite combination antiretroviral therapy. AIDS. 26 (7), 843-853 (2012).
- Heggelund, L., et al. Stimulation of toll-like receptor 2 in mononuclear cells from HIV-infected patients induces chemokine responses: possible pathogenic consequences. Clinical and Experimental Immunology. 138 (1), 116-121 (2004).
- Hernandez, J. C., et al. Up-regulation of TLR2 and TLR4 in dendritic cells in response to HIV type 1 and coinfection with opportunistic pathogens. AIDS Research and Human Retroviruses. 27 (10), 1099-1109 (2011).
- Hernandez, J. C., Latz, E., Urcuqui-Inchima, S. HIV-1 induces the first signal to activate the NLRP3 inflammasome in monocyte-derived macrophages. Intervirology. 57 (1), 36-42 (2014).
- Low, H. Z., et al. TLR8 regulation of LILRA3 in monocytes is abrogated in human immunodeficiency virus infection and correlates to CD4 counts and virus loads. Retrovirology. 13, 15 (2016).
- Sachdeva, M., Sharma, A., Arora, S. K. Functional Impairment of Myeloid Dendritic Cells during Advanced Stage of HIV-1 Infection: Role of Factors Regulating Cytokine Signaling. PLoS ONE. 10 (10), e0140852 (2015).
- Sachdeva, M., Sharma, A., Arora, S. K. Increased expression of negative regulators of cytokine signaling during chronic HIV disease cause functionally exhausted state of dendritic cells. Cytokine. 91, 118-123 (2017).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116 (2), 281-297 (2004).
- Li, H., Jiang, T., Li, M. Q., Zheng, X. L., Zhao, G. J. Transcriptional Regulation of Macrophages Polarization by MicroRNAs. Frontiers in Immunology. 9, 1175 (2018).
- Hu, X., et al. Genome-Wide Analyses of MicroRNA Profiling in Interleukin-27 Treated Monocyte-Derived Human Dendritic Cells Using Deep Sequencing: A Pilot Study. International Journal of Molecular Sciences. 18 (5), (2017).
- Huang, J., et al. MicroRNA miR-126-5p Enhances the Inflammatory Responses of Monocytes to Lipopolysaccharide Stimulation by Suppressing Cylindromatosis in Chronic HIV-1 Infection. Journal of Virology. 91 (10), (2017).
- Lodge, R., et al. Host MicroRNAs-221 and -222 Inhibit HIV-1 Entry in Macrophages by Targeting the CD4 Viral Receptor. Cell Reports. 21 (1), 141-153 (2017).
- Ma, L., Shen, C. J., Cohen, E. A., Xiong, S. D., Wang, J. H. miRNA-1236 inhibits HIV-1 infection of monocytes by repressing translation of cellular factor VprBP. PLoS ONE. 9 (6), e99535 (2014).
- Riess, M., et al. Interferons Induce Expression of SAMHD1 in Monocytes through Down-regulation of miR-181a and miR-30a. Journal of Biological Chemistry. 292 (1), 264-277 (2017).
- Buchacher, T., Ohradanova-Repic, A., Stockinger, H., Fischer, M. B., Weber, V. M2 Polarization of Human Macrophages Favors Survival of the Intracellular Pathogen Chlamydia pneumoniae. PLoS ONE. 10 (11), e0143593 (2015).
- Jaguin, M., Houlbert, N., Fardel, O., Lecureur, V. Polarization profiles of human M-CSF-generated macrophages and comparison of M1-markers in classically activated macrophages from GM-CSF and M-CSF origin. Cellular Immunology. 281 (1), 51-61 (2013).
- Lacey, D. C., et al. Defining GM-CSF- and macrophage-CSF-dependent macrophage responses by in vitro models. Journal of Immunology. 188 (11), 5752-5765 (2012).
- Tarique, A. A., et al. Phenotypic, functional, and plasticity features of classical and alternatively activated human macrophages. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 53 (5), 676-688 (2015).
