הכנה לדוגמא לתרסיס אלקטרונון מהמוני ספקטרומטר מונמטריה

ספקטרומטר מסה (MS) הוא מימוש טכנולוגי של הרדונות; היא מקטינה את מטרת הניתוח ליחידה שניתן לפרש על בסיס מינים מולקולריים או מפלים. לכן, זוהי שיטה ייצוגית לכימיה אנליטית. הוא מורכב מארבעה תהליכים: אינון, ניתוח, גילוי ורכישה ספקטרלית. מכיוון שיינון של המולקולה הוא התהליך הראשון בספקטרומטר מסה, הוא בדרך כלל מגביל את צורת האנליטים שיעובדו. רוב ההליכים האינון דורשים השמדת מבנה, מורפולוגיה ותהליכים ביולוגיים בזמן אמת של דגימות אורגניות. לדוגמה, בתרסיס אלקטרונון (ESI) MS דורש כי הדגימות יהיו במצב נוזלי עבור אינון יעיל¹. לפיכך, יש לעבור דוגמאות להכנה ביוכימית מורכבת, המשנה את הרכב המולקולות. לחילופין, בעוד באמצעות מטריקס באמצעות לייזר באמצעות desorption (maldi) MS יכול לשחזר מפות מולקולריות דקה רקמות מנות^2,3, יעילות יינון שלה הוא נמוך מדי כדי לזהות את כל המולקולות בדגימות, והוא עני במיוחד בניתוח חומצות שומן. בהתחשב מגבלות אלה, בדיקת אלקטרונון בדיקה (PESI)⁴ ניתן להשתמש כדי להתבונן בזמן אמת שינויים במערכות ביולוגיות באתרו מבלי להרוס את השלמות המבנית⁵, בעוד האורגניזם הביולוגי להיות נצפתה הוא מבחינה טכנית במצב חי. מחט נאה מאוד משמשת במקרה זה, המשמש בו זמנית כבוחר לדוגמה ופולט יונים. משמעות הדבר היא כי המדגם מורכבים רצפים טרום טיפול ניתן עקף כדי לקבל ספקטרום מסה המשקפים את הרכיבים המולקולריים של מערכת החיים באתרו.

ישנן מספר שיטות אינון אחרות היריבות PESI-MS. האחד הוא מהיר הסלע אינון ספקטרומטר המסה (ריימס)⁶. טכניקה זו פועלת היטב במהלך הניתוח משום שהוא מורכב עם סכין חשמלי אוספת את הפלומה יון שנוצר במהלך החיתוך. בעוד ריימס הוא מאוד שימושי עבור הניתוח, זה ביסודו שיטה הרסנית הדורשת אבלציה חשמלי של הרקמה. לפיכך, היא אינה שימושית לניתוח מפורט של תאים ורקמות במדגם מוכן או בניתוחי מעבדה. יתר על כן, משום שהיא אוספת כמות גדולה של פלומה המכילה פסולת רקמות, זה דורש תחזוקה ממושכת של המכשירים לאחר כל שימוש, ובכך להגביל את השימוש במכונה זו הליכים כירורגיים מיוחדים. שיטה דומה, הנקראת לייזר הספקטרומטר המסה (LDI-MS)⁷, היא טכניקה נוספת שאינה פולשנית ושימושית עבור ניתוח פני השטח. מכיוון שטכניקה זו טובה בסריקת פני השטח של הדגימה, היא משיגה ניתוח דו מימדי כולל כגון הדמיה מלדית מיסה מאסיבית^8,9. עם זאת, מכיוון LDI-MS חל רק על ניתוח פני השטח, PESI-MS הוא יתרון עבור ניתוח דגימות למשל, בתוך הרקמה. טכניקה נוספת, מספרט עט¹⁰, דווחה כדי להשיג ספציפיות ורגישות באבחון סרטן בלוטת התריס, אבל קוטרו של החללית הוא בסדר mm והוא ספציפי עבור ניתוח פני השטח, כלומר זה לא יכול לזהות גושים קטנים של סרטן או נגעים מקומי עמוק. כמו-כן, מאחר ששיטה זו משתמשת בתעלת זרימה מיקרוקפילר המוטבעת בעט המקדח, הזיהום הצולב חייב להילקח בחשבון, בדומה ל-LDI-MS. טכניקות אחרות קיימות שהוחלו על הגדרות קליניות, כגון בדיקת זרימה וטופס יינון בספוגית¹¹, אבל הם לא נפוצים.

PESI הוא המזעור הקיצוני של ESI, שבו הנימים של הננו-electrospray ממיר על מחט מוצק עם עקמומיות טיפ רדיוס של כמה מאות ננומטר. אינון מתרחש באזור המוגבל ביותר של קצה המחט על ידי יצירת חרוט טיילור, על אילו דגימות להישאר עד אינון של כל הנוזלים על הקצה הוא השלים¹². אם האנליטה נשאר על קצה המחט מתכת, עודף מטען הוא שנוצר ברציפות בממשק בין מחט מתכת לבין האנליטים. לכן, אינון סדרתי של מולקולות מתרחשת בהתאם לפעילות המשטח שלהם. מאפיין זה הופך את המחט טיפ סוג של chromatogram, הפרדת האנליטים בהתאם לפעילות המשטח שלהם. יותר מבחינה טכנית, מולקולות עם פעילות המשטח חזקה לבוא אל פני השטח של החרוט טיילור והם מוהים מוקדם יותר מאשר אלה עם פעילות משטח חלש, אשר לדבוק פני השטח של המחט עד סוף תהליך יונן. כך, אינון מלאה של כל המולקולות שנאספו על ידי המחט מושגת¹³. יתר על כן, כי טכניקה זו אינה כרוכה בתוספת של הממס המיותר למדגם, כמה מאות של ליטרים של נשים מספיקות כדי לקבל ספקטרום מסה חזק מספיק לניתוח נוסף¹⁴. מאפיינים אלה הם יתרון לניתוח של דגימות ביולוגיות שלמות. עם זאת, החיסרון העיקרי של PESI-MS טמון הרציפות באינון בגלל התנועה המעברת של המחט לאורך הציר האנכי, דומה מכונת ניסור. היינון מתרחש רק כאשר קצה הגשוש מגיע לנקודה הגבוהה ביותר כאשר גובה פתח היונים מיושר על הציר האופקי. אינון מפסיק בזמן שהמחט מרימה דגימות, ולכן היציבות של אינון אינה שווה לזו ב-ESI המקובלת. לכן, PESI-MS אינה שיטה אידיאלית עבור פרוטאומניקס.

עד היום, PESI-MS הוחל בעיקר על ניתוח של מערכות ביולוגיות, כיסוי מגוון רחב של שדות ממחקר בסיסי הגדרות קליניות. לדוגמה, הניתוח הישיר של רקמת האדם שהוכנו במהלך הניתוח היה מסוגל לחשוף את הצטברות של triacylglycerol הן קרצינומה של תאי הכליה¹⁵ ו קרצינומה של הלוע הלבן¹⁶. שיטה זו יכולה גם למדוד דגימות נוזל, כגון דם, כדי להתמקד בפרופיל השומנים. לדוגמה, מולקולות מסוימות כללו במהלך שינויים תזונתיים בארנבים; זה דווח כי כמה מולקולות אלה ירדו בשלבים מוקדמים מאוד של הניסויים, המציין את רגישות גבוהה והתועלת של מערכת זו עבור אבחון קליני¹⁷. יתרה מזאת, בקשה ישירה לבעלי חיים חיה אפשרה גילוי של שינויים ביוכימיים של הכבד לאחר לילה אחד של צום⁵. Zaitsu et al.¹⁸ בקרה זה ניסוי⁵ וניתח את פרופילי חילוף החומרים של הכבד כמעט באותו האופן, עם תוצאות שחיזקו את היציבות והתוכעות של השיטה המקורית שלנו. יתר על כן, הצלחנו להפלות את רקמת סרטן מתוך הכבד שמסביב סרטניים בעכברים באמצעות טכניקה זו¹⁹. לכן, זוהי טכניקה מגוונת של ספקטרומטר המסה השימושית בקביעות שונות, הן בvivo והן במבחנה. מנקודת מבט אחרת, ניתן להכניס את מודול PESI להתאמת מספר גדול של ספקטרומטר מסה על-ידי התאמת הקובץ המצורף הגובר. במאמר קצר זה, אנו מציגים את היסודות ודוגמאות של יישומים (איור 1), כולל יישומים עם חיות חיים⁵.

על פי התקנות והחוקים בכל מדינה, יש לסדר חלקים מפרוטוקול זה כדי לעמוד בקריטריונים של כל מוסד. היישום לאורגניזם החי הוא המעניין והמאתגר ביותר משום שהוא יכול לספק שינויים ביוכימיים או מטבוליים ברקמות או באיברים בבעלי חיים באתרו. בעוד שיישום זה אושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים באוניברסיטת יאמאנאשי, בשנת 2013⁵, סיבוב נוסף של אישור יהיה כעת הכרחי בגלל השינויים האחרונים בתקנות עבור ניסויים בבעלי חיים. לכן, מספר שינויים במזימה הניסיונית, מומלץ. לגבי הספקטרום ההמוני שהושג בניסויים, לקיחת תנודות של ספקטרום מסה בין כל מדידה לחשבון, אין מערכת שיתוף מידע ספקטרלי כי הוא משותף הקהילה הרצף נוקלאוטיד. הטיפול חייב להילקח כאשר המפעיל מטפל במחט כדי למנוע תאונות מקל המחט, במיוחד בעת הסרת המחט ממחזיק המחט. מכשיר מיוחד לניתוק המחט הוא מאוד שימושי למטרה זו. מאחר שהתא של מודול PESI הוא תא אטום, סגור, דליפה של הפלומה יון לא מתרחש אם ספקטרומטר המסה מופעל על פי ההוראות.