高密度DNAおよびRNAマイクロアレイ - 光リソグラフィー合成、ハイブリダイゼーション、大型核酸ライブラリーの調製

1. マイクロアレイ設計 テキストエディタで合成するシーケンスを書きます, 5’→3′, シーケンスごとに1行.品質管理25merの場合は、シーケンス「GTCATCATCATGAACCCTCTTC」を使用します。DNAヌクレオチドにはA、C、G、T文字、RNAヌクレオチドには5、6、7、8の数字を使用します。 ライブラリの準備の場合は、各シーケンスの 3′ 末端に追加の数値 (つまり、9) を追加します。これは、ベースセンシティブモノマーのカップリングに対応します。 各シーケンスの後にコンマを付けなければなりません。コンマの後の各シーケンスに名前を割り当て、各レーンが [シーケンス,#sequence_name]形式 (角かっこなしなし) に従っていることを確認します。シーケンスの一覧を .txt ファイルとして保存します。 MatLab を起動し、プログラムChipDesign.mを読み込みます。プログラムを実行します。 プロパティパネルウィンドウで、マイクロアレイのEntireChipレイアウトファイルをロードします。目的が4つの同一の場所で配列全体を合成することを目的としている場合は、MilliChipレイアウトファイルをロードします。 [プロパティパネル] ウィンドウで、[チップ仕様]の [コンテナー]を選択し、[合成領域]を選択します。[パターン]で、アドレス指定可能なフィーチャの正しい量を生成するパターンを選択し、シーケンス数をカウントする品質管理 25mer の場合は、25:36 パターンを選択します。 [コンテナーを選択]で、[Fiducial] を選択します。 フィデューシャル特徴は、通常、合成領域のコーナーで合成され、ハイブリダイゼーションデータを抽出するために使用されます。Fiducial を選択すると、受託機能に合成され、正のコントロールとして機能するシーケンス (5’→3′) を記述します。25mer実験では、同じDNA配列を使用します。 [シーケンス]で、書き込まれたすべてのシーケンスを含むテキスト ファイルを読み込みます。ランダム化が選択されていることを確認します。プロジェクトタイトルの実験にタイトルを付け、リンカーシーケンスでTTTTTを書きます(T5リンカーに対応)。 [生成]を押し、MaskGen_delta_rc1/Designsフォルダーの下にある配列設計ファイルとマスク (図2) を検索します。表示スクリプト、フローシーケンス、およびデザイン ファイルが含まれていることを確認します。 ライブラリの準備のために、表示スクリプトを開きます。スクリプトの最初の行を正確にコピーする表示スクリプトの下部に余分な行を追加します(First_Mask.bmp 150を表示します)。これは、すべてのオリゴヌクレオチドの5’末端で末端光保護群を除去する。 ジョブ作成者AutoJobプログラムを起動し、[テンプレートの読み込み] をクリックしてテンプレートを読み込み、[スクリプトの表示]をクリックして、MatLab によって生成された表示スクリプト ファイルを読み込みます。を押します。この手順では、ジョブファイルと呼ばれる一連の命令を作成し、マイクロミラーとDNAシンセサイザーとのコンピュータの通信を制御します。 2. スライドの準備と機能化 合成セル上の入口と出口チューブの位置に対応する 2 つの位置に 1 つのスライドをドリルします。CNC ルータで 0.9 mm のダイヤモンド ビットを使用して、正確かつ確実にドリルします。掘削されたスライドを超純水ですすいで、スライドラックに並べ替えます。 アンモニアベースの特殊目的クリーナーの5%を含む水浴でスライドを35°Cで30分間超音波処理して表面をきれいにします。スライドを二重蒸留H2 Oで洗い流し、清潔で乾燥したラックに移します。 ドリルラックにドリルおよびドリルされていない顕微鏡スライドを配置します。大型の等級シリンダでは、475mLのエタノール(EtOH)をddH2Oの25mL、10gのシラン化試薬(N-(3-トリトキシシルプロピル)-4-ヒドロキシブチルアミド)と1mLの酢酸を混合して機能化溶液を調製する。均質になるまでよくかき混ぜ、適切な閉じた容器に移します。 ロードされたラックを容器に入れ、蓋を閉じ、室温で4時間の軌道シェーカーにそっと揺らせます。 4時間後、機能化溶液を廃棄し、EtOHの475 mL、ddH 2Oの25mL、酢酸1mLからなる洗浄液の500 mLに置き換えます。室温で20分間ゆっくりと撹拌し、廃棄し、500 mLの新鮮な洗浄液に置き換えます。 室温でさらに20分後、溶液を廃棄し、アルゴンの流れでスライドを乾燥させ、120°Cで予熱した真空オーブンでそれらを硬化させます。2時間後、オーブンと真空ポンプをオフにしますが、一晩減圧下にスライドを残します。その後、オーブンを大気圧に戻し、さらに使用するまでスライドをデシケータに保管します。 3. 合成試薬及び反応剤の調製 リンアミド粉末(図1)を貯蔵温度(-25または-45°C)からデシケータの室温に持ち込みます。 リンアミド酸塩が室温に達したら、標準DNAおよびRNAリンアミド化物の30mM濃度に達するために、超乾燥アセトニトリル(<30 ppm H2O)の体積で粉末を溶解し、ベース感受性dTモノマー(塩基感受性dTモノマーに対して50mM)ライブラリの準備)。湿度の痕跡をトラップするために、小さな分子ふるい袋を追加します。 イミダゾール11gを乾燥DMSOの1Lに溶解することにより、DMSOで1%(w/w)イミダゾールの溶液を調出す。完全に溶解するまでよく振ります。溶液をDNAシンセサイザの補助ポートに取り付けます。これは、5′-フォトプロテクション群の完全な除去に必要な露光溶媒になります。 ライブラリーの合成のために、ジクロロメタンの100mgのβ-カロテンを10mLのジクロロメタンに溶解することにより、ジクロロメタン中の1%(w/v)β-カロテンの溶液を調製する。琥珀色のガラス瓶でよく振り、アルミホイルで包みます。 4. マイクロアレイ合成の準備とモニタリング マイクロアレイ製造室の温度と湿度を記録し、DNAシンセサイザーが十分なヘリウム圧力下にあることを確認します。 UV-LEDとその冷却ファンの電源を入れます。入ってくる紫外線の焦点面にUV強度計を取り付け、オンにします(図3A)。 コンピュータで、ジョブファイル/マイクロミラー/合成ファイルコントローラソフトウェア(WiCellという名前)を起動します。次に、マイクロミラー デバイスを初期化し、DMD を右クリックしてオール ホワイトマスク ファイルを読み込み、[イメージの読み込み]を選択します。 UVS アイコンを右クリックし、[UVシャッターを開く]を選択します。強度計の電力値(mW/cm2)を読み取り、60sを数えます。60 度後、電力値をもう一度読み取り、開始値と終了値を書き留めます。UVシャッタークローズを選択してシャッターを閉じ、強度計をオフにします。mW/cm 2 の平均 UV 強度値を計算します。 5′-NPPOCフォトデプロテクション(DNAおよびRNAマイクロアレイ)の6J/cm2の放射エネルギーに到達するために必要な露光時間を計算し、5′-BzNPPOCフォトデプロテクション(DNAライブラリ)の場合は3J/cm2を、単に関係に従って計算します。 DNAシンセサイザーワークステーションソフトウェアで、MatLabによって生成されたフローシーケンスの内容をコピーして貼り付けることによって、シーケンスエディタにシーケンスファイルを作成します。最初のカップリングに進む前に基板の表面を洗浄するために、3’端(デフォルトのサイクル文字:「s」)に余分な2つの洗浄ステップを追加します。シーケンス ファイルを保存してエクスポートします。 ワークステーション ソフトウェアのプロトコル エディタで、シーケンス ファイルに存在する各文字と数字にちなんで名付けられた専用サイクルを含むプロトコルを作成します (シーケンス ファイルに文字 A、C、G、および T のみが含まれている場合など)。A、C、G、および T という名前の 4 つのサイクルが含まれています) DNAホスホラミド(サイクルA、C、G、T)の結合時間を15sに設定し、rUリンホラミサイト(サイクル8)では120s、rA、rCおよびrGリンアミド(サイクル5、6、7)の場合は300sに設定します。ライブラリの準備のために、ベース感度の高いクリーブ可能な dT モノマーのカップリングを 2 × 120 s (表1および表 2)に設定します。 各サイクルの 2 つのイベント 2 Out通信イベント間の待機時間が、必要な放射エネルギーに到達するために計算された UV 露出時間に対応していることを確認します。シーケンス ファイルに関しては、プロトコル ファイルを保存してエクスポートします。 WiCellソフトウェアで、それぞれのサブウィンドウにジョブ、シーケンス、プロトコルファイルをロードし、[送信]をクリックして、シーケンスファイルとプロトコルファイルをDNAシンセサイザーに送信します。 シーケンス ファイルで、各リンアミドマイトの結合数をカウントします。 各合成を実行するために必要なリンアミド溶液の必要量(μL単位)を測定するには、カップリングの数に60を掛けます。DNAシンセサイザー上のラインの安全性とプライミングのために各容積に250 μLを追加します。単一のカップリングのみを必要とするリンアミドには、250 μL のベースボリュームを使用します。 プロトコルサイクルのポート文字/番号に対応するDNAシンセサイザー上のバイアルに溶液を素早く転送します。 リンアミド化溶液でポートをプライムにし、試薬でラインを満たすために、それぞれ10個の素数パルスを使用します。反応細胞を取り付ける前にアセトニトリル洗浄ラインをプライムする。 合成細胞を組み立てるには、細胞の石英ブロック上に最初に厚い(250 μm)パーフルオロエラストマー(FFKM)ガスケットを置きます。最初のガスケットの上に掘削された機能性顕微鏡スライドを置き、スライドの穴が合成細胞の入口および出口管と接続していることを確認します。 2つ目の薄い(50 μm)ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)ガスケットを掘削スライドの上に置き、2つの穴を囲みます。最後に、2番目のガスケットの上に2番目の機能を持つが未掘削のスライドを置きます(図3B)。組み立てられた二重基板セルの上に4ネジメタルフレームを置き、トルクドライバを使用して同じクランプ力(0.45 Nm)にネジを締めます。 入口と出口チューブをDNAシンセサイザーに取り付けます。アセトニトリル洗浄ラインをプライムし、基板を介したアセトニトリル(ACN)の適切な流れを確認します。この段階でACNの漏れが観察できる場合は、細胞を分解して再組み立てます。ACNプライミングの7サイクルを経た後、廃棄物ラインでのACNの体積を測定します。このボリュームは 2 mL である必要があります。 入ってくる紫外線の焦点面に合成セルを取り付けます。図書館調製の場合は、余分な入口と出口線をセルの背面に取り付け、β-カロテン溶液で裏室を充填する(溶液の2mLで十分である)。漏れがないことを確認してください(図3C)。 最初に WiCell ソフトウェアで実行をクリックして合成を開始します。ジョブ・ファイルの最初の WAIT コマンドで、DNA シンセサイザーの[スタート]を押します。 合成中に、マスクファイルの表示が紫外線露光とシャッターの開口部と一致することを定期的に確認します。 通常のマイクロアレイを合成した後、シンセサイザーから細胞を切断し、細胞を分解し、ダイヤモンドペンを使用して合成番号をガラススライドにエッチングします。各スライドの非合成面の番号をエッチングします。スライドを50 mL遠心チューブに移し、さらに使用するまで乾燥した場所に保管してください。 ライブラリーマイクロアレイの合成後、まずβ-カロテン溶液をチャンバから排出し、次にCH2Cl2の2×5 mLを流して洗浄し、次に排水する。ステップ 4.21 に準拠して分解を続行します。合成された配列は肉眼で見えるかもしれません(図4)。 5. DNAマイクロアレイの保護解除 染色ガラス瓶に20mLのEtOHと20 mLのエチレンディアミン(EDA)を充填します。DNAのみのマイクロアレイを瓶の中に縦に置き、蓋を閉め、スライドを残して室温で2時間保護します。注意:EDAは、急性毒性、腐食性および可燃性液体である。換気の良いヒュームフードで手袋を使用します。 2時間後、ピンセットを使用してスライドを取り出し、二重蒸留H2 Oで十分にすすいでください。 マイクロアレイ遠心分離機でスライドを数秒間乾燥させ、その後、デシケータに保存します。 6. RNAマイクロアレイの保護解除 50 mL遠心管で、2:3トリエチルアミン/ACN(それぞれ20mLおよび30mL)の乾燥溶液を調出す。1つのRNAマイクロアレイスライドを遠心管に移し、蓋を閉じてからプラスチックシールフィルムで包みます。室温で1時間30分、軌道シェーカーで遠心管をゆっくりと振ります。 1時間30分後、スライドを取り外し、2×20mLの乾燥ACNで洗浄し、マイクロアレイ遠心分離機で数秒間乾燥させます。注意: トリエチルアミンは、急性毒性、腐食性および可燃性液体です。アセトニトリルは有毒で可燃性です。換気の良いヒュームフードで手袋を使用します。注: 最初の保護解除手順が完了しました。 0.5Mヒドラジン水和液を3:2ピリジン/酢酸で調圧します。まず、20mLの酢酸と30mLのピリジンを等級シリンダーに混ぜます。1.21 mLのヒドラジン水和物を加える前に、溶液が冷却するのを待ちます。得られた溶液の約40 mLを50mL遠心管に移す。注意:ヒドラジン水和物は、急性毒性と腐食性液体です。ピリジンは非常に可燃性で急性毒性があります。酢酸は可燃性で腐食性があります。換気の良いヒュームフードで手袋を使用します。 最初の脱保護工程の後、RNAスライドをヒドラジン水和液に移し、蓋を閉じてプラスチックシールフィルムで包む。室温で2時間、軌道シェーカーでチューブをゆっくりと振ります。2時間後、スライドを取り外し、2×20 mLの乾燥ACNで洗浄し、マイクロアレイ遠心分離機で数秒間乾燥させます。注: 2 回目の保護解除ステップが完了しました。 RNAマイクロアレイにもDNAヌクレオチドが含まれている場合は、第3の保護解除工程を進めます。50 mLの遠心管で、EDAの20 mLをEtOHの20 mLと混合する。DNA/RNAマイクロアレイを1:1 EDA/EtOH溶液に追加し、室温で5分間放置します。 5分後、スライドを取り外し、2×20 mLの滅菌水で洗浄し、マイクロアレイ遠心分離機で乾燥させ、デシケータに保管します。 7. 蛍光標識された相補鎖とのハイブリダイゼーション アセチル化牛血清アルブミン(10mg/mL)とCy3ラベルの相補鎖(100nM)を解凍し、室温まで温めます。 1.5 mLの無菌マイクロ遠心管で、 2x MESバッファーの150 μL(200 mM 2-(N-モルフォリーノ)エタンスルホン酸;1.8M NaCl;40 mM EDTA;0.02% Tween-20)をCy3標識DNAの26.7 μL、アセチル化BSAおよび1μLの13.4 μLを混合する。渦。両方のスライドをハイブリダイゼーションに使用する場合は、ボリュームを 2 倍にします。 ハイブリダイゼーションオーブンをデュプレックスのTm以下の温度にあらかじめ温めますが、フルマッチシーケンスと非一致シーケンスの間で良好な判引を確保するのに十分な高さです。品質管理25merの場合は、温度を42°C(59°CのTm)に設定します。 上記で調製したハイブリダイゼーション溶液中の各スライドおよびピペの合成領域の上に、自己接着性300μLハイブリダイゼーションチャンバを慎重に配置します。接着ドットでチャンバーの穴を覆い、アルミ箔でスライド全体を包みます。 マイクロアレイスライドをハイブリダイゼーションオーブンに入れ、カバーし、選択したハイブリダイゼーション温度で2時間ゆっくりと回転させます。 2時間後、スライドを取り外し、アルミ箔を取り外し、ハイブリダイゼーションチャンバを慎重に引き裂きます。スライドを30mLの非ストリンジェント洗浄バッファー(NSWB;0.9M NaCl、0.06 Mリン酸塩、6 mM EDTA、0.01%Tween20、pH 7.4)を含む遠心管に移し、室温で2分間激しく振ります。 30 mLのストリンジェントウォッシュバッファ(SWB;100mM MES、0.1 M NaCl、0.01%Tween20)を含む遠心管にスライドを移し、1分間激しく振ります。 最後に、最終洗浄バッファー(FWB;0.1x塩水ナトリウム)の30 mLを含む遠心管にスライドを移し、数秒間振ります。スライドをマイクロアレイ遠心分離機で乾かします。 ドライマイクロアレイを下向きに、マイクロアレイスキャナのスライドホルダーに入れます。Cy3 ラベル付きデュプレックスの場合は、532 nm の励起波長、575 nm フィルター、および 350 のフォトマルチプライヤを使用して、5 μm の解像度でスキャンします。高解像度スキャンを .tif イメージ ファイルとして保存します (図 5A)。 8. データ抽出・分析 データ抽出の前に、保存したアレイスキャンをイメージエディタで回転させて、スキャンの左上隅にある最も長い線維機能のチェーンを配置します。回転した画像を保存します。 NimbleScanを起動し、ファイルを押す |配列スキャンを開いて読み込みます。次に、[デザインファイル] サブセクションの [参照] をクリックして、 を読み込みます。マイクロアレイ実験の設計中に自動的に生成されたndfデザインファイル。次に、[開く]をクリックします。 [ビュー]で、[自動コントラスト/明るさ]をクリックします。スキャンの上に手動で揃えるアイコンをクリックします。スキャンの 4 つのコーナーに 4 つの正方形のマーカーを配置し、もう一度緑色のアイコンをクリックします。[分析]をクリックしてハイブリダイゼーション データを抽出し、[レポート]をクリックしてからプローブレポートをクリックします。 を開きます。スプレッドシート エディタのプローブレポート ファイル。列 B と I を保持し、抽出されたデータからの平均値と標準偏差の計算を続行する前に残りを破棄します (図 5B)。 9. 図書館の保護解除、切断、回収 DNAライブラリを脱保護して切り分けるには、50 mL遠心管に1:1乾燥EDA/トルエンの溶液を調調します。 スライドを切断液に浸し、スライドを閉じてプラスチックシールフィルムで包み、室温で2時間の軌道シェーカーで穏やかに回転させます。 2時間後、スライドを取り出し、綿密に乾燥したACNの2×20 mLで洗浄します。スライドを取り外し、空気を乾燥させます。 ピペットを使用して、現在識別可能な合成領域の上に無菌H2 Oの100 μLを適用します。溶液を1.5 mLマイクロ遠心管に移す前に、溶液を数回上下にピプティングします。このプロセスを繰り返し、同じチューブに溶出するマイクロアレイを組み合わせます(図6)。 2×100μLのチップを蒸発して乾燥させ、ヌクレアーゼフリーH2Oの10μLに再溶解し、UV-Vis分光光度計で吸光度を測定します。 C18樹脂を装備した10 μLピペット先端のDNAライブラリーを脱塩します。まず、溶出チップを0.1Mトリエチランモニウム酢酸トリエチランモニウム(TEAA)緩衝液に変換します。 H2 O/ACN 1:1の3 x10 μLを目指して樹脂を濡らし、0.1 M TEAAバッファーの3 x 10 μLで洗浄して樹脂を平衡化します。チップをピペッティングしてDNAを結合し、樹脂を通して10回上下に溶出します。0.1 M TEAA バッファーの 3 x 10 μL、H2O の 3 x 10 μL で樹脂を洗浄します。 H2O/ACN 1:1の10μLで樹脂を洗浄することにより、先端から脱塩DNAを溶出します。脱塩溶液を乾燥させ、無菌H2 Oの10 μLに再溶解し、UV-Vis分光光度計で吸光度を測定します(図7)。ライブラリを蒸発して乾燥させ、さらに使用するまで-20°Cで保存します。