高密度DNA和RNA微阵列.光刻合成、杂交和制备大型核酸库

1. 微阵列设计 在文本编辑器中编写要合成的序列,每个序列 5’*3′,一行。对于质量控制 25mer,请使用序列”GTCATCATCATACCCTCT”。对DNA核苷酸使用A、C、G和T字母,对RNA核苷酸使用5、6、7和8个编号。 在库准备的情况下,在每个序列的 3′ 末尾添加一个额外的数字(即 9)。这将对应于基敏单体耦合。 每个序列后面必须跟一个逗号。在逗号之后为每个序列指定一个名称,并验证每个通道是否遵循 [序列,#sequence_name]格式(不带括号)。将序列列表另存为 .txt 文件。 启动 MatLab 然后加载程序芯片设计.m.运行程序。 在”属性面板”窗口中,加载微阵列整个Chip布局文件。如果目标是在四个相同的位置合成整个数组,则加载MilliChip布局文件。 在”属性面板”窗口中,在”芯片规格”下,选择”选择容器然后合成区域”。在”模式”下,选择产生正确数量的可寻址特征的模式,计算序列数 = 复制数。对于质量控制 25mer,选择 25:36 模式。 在”选择容器”下,选择”基准”。基准特征通常在合成区域的角落合成,用于提取杂交数据。选择基准时,编写一个序列(5’+3′),该序列将在基准特征上合成,并可作为正控制。对于25mer实验,使用相同的DNA序列。 在”序列”下加载包含所有已写入序列的文本文件。确保选择了”随机化”。在项目标题中为实验提供标题,并在链接序列中写入TTTTT(对应于 T5链接器)。 按”生成”,然后查找MaskGen_delta_rc1/设计文件夹下的数组设计文件和掩码(图2)。 确保它包含显示脚本、流序列和设计文件。 有关库准备,打开显示脚本。在显示脚本底部添加一行,以精确复制脚本的第一行(例如,显示 First_Mask.bmp 150)。这将删除所有寡核苷酸的5’端的终端光保护组。 启动作业创建者AutoJob程序,通过单击”加载模板”加载模板加载模板,然后单击”显示脚本”以加载由 MatLab 生成的显示脚本文件。 按”生成”。此步骤将创建一系列指令,称为作业文件,将控制计算机与微镜和 DNA 合成器的通信。 2. 幻灯片准备和功能化 在与合成单元上入口和出口管位置相对应的两个位置钻一个滑块。在 CNC 路由器上使用 0.9 mm 金刚石钻头进行精确、可靠的钻孔。用超纯水冲洗钻孔的幻灯片,并将其放在滑架中。 在含有5%的氨基特殊用途清洁剂的水浴中,在35°C下,将滑梯进行超声波处理,以清洁表面30分钟。用双蒸馏 H2O 冲洗幻灯片,并将其转移到干净干燥的机架中。 在滑动机架中排列钻孔和未钻孔的显微镜幻灯片。在大的分级气缸中,通过将 475 mL 乙醇 (EtOH) 与 25 mL ddH2O、10 g 的硅化试剂(N-(3-三乙酰丙基)-4-羟基丁酰胺)和 1 mL 醋酸混合制备功能化溶液。搅拌良好,直到均匀,然后在一个合适的封闭容器中转移。 将装载的机架放入容器中,合上盖子,让容器在室温下轻轻摇动轨道摇床 4 小时。 4小时后,丢弃功能化溶液,用500 mL的洗涤溶液替换,包括475 mL的EtOH、25 mL的ddH2O和1 mL的醋酸。在室温下缓慢搅拌20分钟,然后丢弃并更换500 mL的新鲜洗涤液。 在室温下再加20分钟后,丢弃溶液,用一串龙流干燥滑片,并在120°C的预热真空烤箱中固化。2 小时后,关闭烤箱和真空泵,但将滑轨放在减压下过夜。然后,将烤箱带回大气压力,并将滑片存放在干燥器中,直到进一步使用。 3. 合成试剂和反应物的制备 将磷酰胺粉末(图1)从储存温度(-25或-45°C)带入干燥器室温。 当磷酰胺达到室温时,用一体积超干醋酸酯(<30 ppm H2O)溶解粉末,以达到标准DNA和RNA磷酰胺的30 mM浓度,基敏dT单体(50 mM)库准备)。加入一个小的分子筛袋,以捕捉任何湿度的痕迹。 在 DMSO 中制备 1% (w/w) 的 imidazole 溶液,将 11 克的 imidazole 溶解到 1 L 的干 DMSO 中。摇匀,直到完全溶解。将溶液连接到DNA合成器的辅助端口。这将是完全去除5°光保护组所需的暴露溶剂。 对于库的合成,通过在10 mL的二氯甲烷中溶解100mgβ-胡萝卜素,制备二氯甲烷中1%(w/v)β-胡萝卜素的溶液。在琥珀色玻璃瓶中摇匀,然后用铝箔包裹。 4. 编制和监测微阵列合成。 在微阵列制造室记录温度和湿度,并确保DNA合成器在足够的氦压下。 打开 UV-LED 及其冷却风扇。将紫外线强度计连接到进入紫外线的焦平面,然后将其打开(图 3A)。 在计算机上,启动作业文件/微镜/合成文件控制器软件(名为WiCell)。打开然后初始化微镜设备,并通过右键单击DMD加载全白掩码文件,然后选择加载图像。 右键单击 UVS 图标并选择UV 快门打开。读取强度计的功率值(以 mW/cm2)并计数 60 s。60 s 后,再次读取功率值,并记下开始和结束值。通过选择 UV快门关闭快门并关闭强度计。计算平均紫外线强度值(以 mW/cm2 )。 计算5′-NPPOC光解保护(DNA和RNA微阵列)的辐射能达到6J/cm2和3 J/cm2为5′-BzNPPOC光解保护(DNA库)所需的暴露时间,只需遵循关系即可。 在DNA合成器工作站软件中,通过复制和粘贴 MatLab 生成的流序列的内容,在序列编辑器中创建序列文件。在 3′ 端(默认循环字母:”s”)上添加额外的两个洗涤步骤,以在移动到第一个耦合之前清洗基板表面。保存并导出序列文件。 在工作站软件的协议编辑器中,创建一个包含以序列文件中每个字母和数字命名的专用周期的协议(例如,如果序列文件仅包含字母 A、C、G 和 T,则协议文件必须包含四个周期,名为 A、C、G 和 T)。 将DNA磷酰胺(周期A、C、G和T)的耦合时间设置为15s,将rU磷酰胺(周期8)设置为120s,将rA、rC和rG磷酰胺(周期5、6和7)设置为300s。对于库准备,将基敏、可夹合的 dT 单体耦合设置为 2 × 120 s(表 1和表 2)。 确保每个周期中的两个事件 2 Out通信事件之间的等待时间与计算出的紫外线照射时间相对应,以达到必要的辐射能量。对于序列文件,保存并导出协议文件。 在 WiCell 软件中,将作业、序列和协议文件加载到其各自的子窗口中,然后单击”发送”将序列和协议文件发送到 DNA 合成器。 在序列文件中,计算每个磷酰胺的耦合数。 要测量执行每次合成所需的磷酰胺溶液的所需体积(μL),请将耦合数乘以60。在每个体积中加入 250 μL,以确保 DNA 合成器上生产线的安全性和启动性。对于只需要单个耦合的磷酰胺石,使用 250 μL 的基本体积。 快速将溶液传输到DNA合成器上的小瓶中,该小瓶与协议周期中的端口字母/编号相对应。 用磷酰胺溶液为端口加注,每个脉冲有10个主脉冲,以便用试剂填充生产线。在连接反应细胞之前,给醋酸酯洗涤线充血。 要组装合成电池,请先在电池的石英块上放置一个厚(250 μm)全氟弹性体 (FFKM) 垫片。将钻孔的、功能化的显微镜幻灯片放在第一个垫片的顶部,并验证滑片上的孔与合成单元的进气口和出口管连接。 将第二个薄 (50 μm) 聚四氟乙烯 (PTFE) 垫片放在钻孔滑道上,环绕两个孔。最后,在第二个垫片上放置第二张功能化但未钻孔的幻灯片(图3B)。将 4 螺钉金属框架放在组装的双基质单元顶部,并使用扭矩螺丝刀将螺钉拧紧至相同的夹紧力 (0.45 Nm)。 将入口和出口管连接到 DNA 合成器。为乙酰乙酰化洗涤管进行充注,并验证乙酰乙酰乙酯 (ACN) 是否通过基板正常流动。如果在此阶段观察到 ACN 的任何泄漏,则拆卸并重新组装电池。经过 7 个 ACN 注油周期后,测量废物管线的 ACN 体积。此卷应为 2 mL。 将合成单元连接到进入紫外线的焦点面。在库准备的情况下,在电池背面附加一个额外的入口和出口线,用β-胡萝卜素溶液填充后室(2 mL溶液就足够了)。确保没有泄漏 (图 3C) 。 首先单击”在 WiCell软件中运行”开始合成。在作业文件中的第一个 WAIT 命令中,按 DNA 合成器上的”开始”。 在合成过程中,定期验证蒙版文件的显示与紫外线照射和快门的打开一致。 合成常规微阵列后,断开细胞与合成器的连接,拆解细胞并使用金刚石笔将合成数蚀刻到玻璃玻片上。蚀刻每张幻灯片的非合成面上的数字。将滑片转移到 50 mL 离心管中,并存放在干燥区域,直到进一步使用。 在合成库微阵列后,首先将β-胡萝卜素溶液排出腔室,然后通过流动2~5 mL的CH2 Cl2将其洗涤,然后排出。按照步骤 4.21 进行拆卸。合成的数组可能是肉眼可见的 (图4)。 5. DNA微阵列解保护 用20 mL的EtOH和20 mL的乙烯胺(EDA)填充染色玻璃罐。将仅脱氧核糖核酸的微阵列垂直放入罐中,合上盖子,然后让幻灯片在室温下脱保护2小时。注意:EDA是一种剧毒、腐蚀性和易燃的液体。在通风良好的通风罩中使用手套。 2 小时后,使用钳子取回幻灯片,并用双蒸馏 H2O 彻底冲洗。 在微阵列离心机中干燥幻灯片几秒钟,然后存放在干燥器中。 6. RNA微阵列脱保护 在50 mL离心管中,制备2:3三乙胺/ACN(分别为20 mL和30 mL)的干溶液。将一个RNA微阵列滑入离心管,合上盖子,然后用塑料密封膜包裹。在室温下,轻轻摇动轨道摇床上的离心管 1 小时和 30 分钟。 1小时30分钟后,取出幻灯片,用2×20 mL干ACN清洗,然后在微阵列离心机中干燥几秒钟。注意:三乙胺是一种剧毒、腐蚀性和易燃的液体。醋酸酯是有毒和易燃的。在通风良好的通风罩中使用手套。注:第一个取消保护步骤完成。 在3:2丙氨酸/醋酸中制备0.5M氢化物水合物溶液。首先,在分级气缸中混合20 mL的醋酸和30 mL的丙氨酸。等待溶液冷却后再加入1.21 mL的氢化物水合物。将产生的溶液的约 40 mL 转移到 50 mL 的离心管中。注意:水合物是一种剧毒和腐蚀性液体。苯丙胺是高度易燃和剧毒的。醋酸是易燃和腐蚀性的。在通风良好的通风罩中使用手套。 第一次脱保护步骤后,将RNA滑移到水合物溶液中,合上盖子,用塑料密封膜包裹。在室温下,轻轻摇动轨道摇床2小时。2小时后,取出幻灯片,用2×20 mL的干ACN清洗,然后在微阵列离心机中干燥几秒钟。注:第二个取消保护步骤完成。 如果RNA微阵列也含有DNA核苷酸,则继续进行第三个去保护步骤。在 50 mL 离心管中,将 20 mL 的 EDA 与 20 mL 的 EtOH 混合。将DNA/RNA微阵列加入1:1 EDA/EtOH溶液,在室温下保持5分钟。 5分钟后,取出滑轨,用2×20 mL的无菌水清洗,然后在微阵列离心机中干燥,并存放在干燥器中。 7. 荧光标记互补链的杂交 解冻乙酰化牛血清白蛋白(10mg/mL)和Cy3标记的互补链(100 nM),并加热至室温。 在1.5 mL无菌微离心管中, 将 150 μL 的 2x MES 缓冲液(200 mM 2-(N -异丙醇) 乙酸酸; 1.8 M NaCl; 40 mM EDTA; 0.02% Tween-20) 与 26.7 μL 的 Cy3 标记 DNA, 13.4 μL 的乙酰化 BSA 和 110 μL 无菌 H2O 混合和.涡。如果两个幻灯片都用于混合,则将卷翻倍。 将混合炉预热至双工Tm以下的温度,但足够高,以确保完全匹配序列和非匹配序列之间的良好区分。对于质量控制 25mer,将温度设置为 42°C(Tm为 59°C)。 在上述混合溶液中,小心地将自粘300μL杂交室放在每张幻灯片上的合成区域和移液上。用粘合点盖住造型室的孔,用铝箔包裹整个幻灯片。 将微阵列幻灯片放入杂交炉中,盖上盖子,让它在选定的杂交温度下轻轻旋转 2 小时。 2 小时后,拆下滑轨,拆下铝箔并小心地撕下混合室。将滑片转移到含有30mL非严格洗涤缓冲液(NSWB;0.9M NaCl,0.06 M磷酸盐,6mM EDTA,0.01%Tween20,pH 7.4)的离心管中,并在室温下剧烈摇动2分钟。 将滑片转移到含有 30 mL 严格洗涤缓冲液(SWB;100 mM MES、0.1 M NaCl、0.01% Tween20)的离心管中,并剧烈摇动 1 分钟。 最后,将滑片转移到含有30mL最终洗涤缓冲液(FWB;0.1x盐酸钠)的离心管中,摇几秒钟。在微阵列离心机中干燥幻灯片。 将干燥的微阵列、合成区域朝下放置在微阵列扫描仪的滑动支架中。对于 Cy3 标签双工,以 5 μm 分辨率扫描,具有 532 nm 激发波长、575 nm 滤波器和 350 倍光倍增器。将高分辨率扫描另存为 .tif 图像文件 (图 5A)。 8. 数据提取和分析 在提取数据之前,在图像编辑器中旋转保存的阵列扫描,以便将最长的基准要素链定位在扫描的左上角。保存旋转的图像。 启动NimbleScan,然后按文件|打开并加载阵列扫描。然后,通过单击”设计文件”小节中的”浏览”,加载 。在微阵列实验设计过程中自动生成的ndf设计文件。然后单击”打开”。 在视图中,单击”自动对比度/亮度”。单击扫描上方手动对齐的图标。在扫描的四个角放置四个方形标记,然后再次单击现在的绿色图标。通过单击”分析”,报告然后探测报告来提取杂交数据。 打开 .在电子表格编辑器中探测报表文件。保留列 B 和 I,在继续计算从提取的数据中计算平均值和标准偏差之前丢弃其余列(图 5B)。 9. 图书馆去保护、裂解和恢复 要消除保护和切下DNA库,在50 mL离心管中制备1:1干EDA/苯基苯溶液。将滑移浸入裂解溶液中,关闭滑块,用塑料密封膜包裹,然后在室温下在轨道摇床中轻轻旋转 2 小时。 2 小时后,取下滑轨,用 2 × 20 mL 的严格干燥 ACN 清洗。拆下滑轨,使其风干。 使用移液器,在现在可识别的合成区域上涂抹 100 μL 无菌 H2O。将溶液上下移动几次,然后再将其转移到1.5 mL微离心管中。重复此过程,并将微阵列 eluate 结合到同一管中 (图 6)。 将2×100 μL的芯片洗至干燥,然后重新溶解成10μL的无核酸酶H2O。测量UV-Vis分光光度计的吸光度。 在配备 C18 树脂的 10 μL 移液器尖端上脱盐 DNA 库。首先,将芯片改液化为0.1M醋酸三乙酸三乙酸(TEAA)缓冲溶液。 通过 H2O/ACN 1:1 的 3 x 10 μL 来润湿树脂,并通过使用 3 x 10 μL 的 0.1 M TEAA 缓冲液洗涤来平衡树脂。通过树脂上下移液10次,结合DNA。用 3 x 10 μL 的 0.1 M TEAA 缓冲液清洗树脂,使用 3 x 10 μL 的 H2O 清洗树脂。 用 10 μL 的 H2O/ACN 1:1 清洗树脂,从尖端洗脱盐的 DNA。将脱盐溶液干燥并重新溶解成10μL无菌H2O.测量UV-Vis分光光度计的吸光度(图7)。将库蒸发至干燥状态,并储存在-20°C,直到进一步使用。