소매 식품 시료에서 클로스트리디움 퍼프린지 독시변의 농축 및 검출

참고: C. perfringens는 생물 안전 위험 수준 2 (BSL2) 유기체로 간주됩니다. 모든 식품 샘플에 C. perfringens가포함되어 있는 것은 아니지만 모든 배양 된 샘플은 이와 같이 취급되어야합니다. 모든 적절한 예방 조치와 인력 보호 장비(PPE)는 항상 착용해야 합니다. 폐기 전에 모든 물질을 오염 제거하십시오. 1. 수정된 RPM4,15 준비 30 g/L 유체 티오글리콜레이트 배지, 60 g/L 젤라틴, 5 g/L 펩톤, 5 g/L 포도당, 5 g/L 인산염 디베이직, 3 g/L 효모 추출물, 1.5 g/L 염화 나트륨, 0.5 g/L 황산나트륨을 균등하게 분산될 때까지 섞습니다. 일반적으로 1L 일괄 처리를 만듭니다. 121 °C에서 15 분 동안 오토 클레이브. 약 40°C까지 식힙니다. RPM이 차가워지면 D-사이클로딘을 최종 농도440 mg/L에 추가하십시오.참고: 50 mg/mL에서 멸균수에 용해된 D-cycloserine의 재고 농도는 향후 사용을 위해 -20°C에 보관될 수 있습니다. 10 mL의 RPM을 15 mL 원엽 튜브로 무균 적으로 전송합니다. RPM은 일괄으로 제조하고 최대 1개월 동안 4°C에서 보관할 수 있다. 사용 전에 RPM을 37°C로 따뜻하게 합니다. 2. 샘플 수집 및 RPM 배양 식품은 1시간 이내의 주변 온도하에서 실험실로 운반할 수 있으며, 식품은 원래 포장 또는 멸균 용기로 운반될 수 있습니다. 즉시 테스트하지 않을 경우, 식품은 사용 될 때까지 -20 °C에서 보관될 수 있습니다. 포장 라벨에 따라 식품의 종류와 원산지(가능한 경우)와 기타 관련 정보를 기록해 둡을 기록하십시오. 약 1.0-2.0 g의 식품을 제거하고 멸균 페트리 접시 또는 이에 상응하는 상태로 옮긴다. 멸균 면도날이나 메스로 잘게 다듬습니다. 15 mL 원추형 튜브에서 인산완충 식염수(PBS)의 10 mL로 접종하였다. 잘 섞으세요. 식물성 세포를 선택하려면, 10 mL의 RPM을 포함하는 15 mL 원엽 관으로 PBS 식품 혼합물의 5 mL를 전송합니다. 뚜껑을 단단히 닫습니다. 포자를 선택하려면, PBS-식품 혼합물의 나머지 5 mL을 85°C에서 15분 동안 가열한 다음 RPM 10 mL을 함유하는 15 mL 원엽 튜브로 옮니다. 뚜껑을 단단히 닫습니다. 완전한 혼합을 보장하기 위해 식품-RPM 배양을 소용돌이 및 반전한다. 원유관을 단단히 밀봉하고 혐기성 환경을 보장하기 위해 파라핀 필름 또는 플라스틱 랩으로 뚜껑을 감쌉니다. 37 °C에서 하룻밤 (ON)을 배양하십시오. 다음 날 아침 RPM 튜브의 탁도 또는 발효에 주의하십시오. 3. TSC “샌드위치” 도금 아래 설명된 “샌드위치” 기법을 사용하여 TSC 한천에 RPM 배양액을 접종합니다(그림2). 제조업체의 지침에 따라 TSC 한천을 준비하십시오. 용융 TSC 한천 10 mL를 멸균 페트리 접시에 옮기고 고형화하여 TSC 플레이트의 베이스 레이어를 준비합니다. 이들은 4°C에서 고급 및 저장하여 제조될 수 있다. 사용하기 전에 플레이트를 실온으로 데운지 확인하십시오. TSC 플레이트의 상부 층의 경우, 나머지 용융 TSC 한천을 40°C에서 유지한다.참고: 한천의 융점이 85°C 이상이지만, 용융된 한천은 약 32-45°C를 고화시입니다. ON RPM 배스를 신중하게 검색하고 TSC 한천 기지로 100 μL을 전송합니다. 발효 때문에 일부 문화는 압력을 받을 수 있습니다. 모든 적절한 PPE를 착용해야합니다. 멸균 된 유리 비드 또는 세포 스프레더를 사용하여 RPM 접종을 확산시다. RPM을 실온에서 5-10분 동안 TSC 한천에 “흡수”할 수 있도록 하십시오. 조심스럽게 혈청 피펫을 사용하여 플레이트에 용융, 40 °C TSC 한천의 20 mL을 전송합니다. 페트리 접시 뚜껑을 교체하고 TSC 한천이 실온에서 완전히 고체화될 수 있도록 하십시오. 페트리 접시를 반전시키고 37°C ON에서 배양한다. 직렬 희석이 필요한 경우, TSC 한천으로 접종하기 전에 ON RPM 배양물의 희석을 신선하고 미리 데운 RPM으로 수행하십시오. 4. 아황산염 감소 식민지의 하위 배양 다음 날 아침, 인큐베이터에서 접시를 제거하고 세균 성장을 검사하십시오. 호기성 박테리아는 한천의 표면에 존재할 수 있다. 혐기성 박테리아는 한천 내에 내장 성장 발견 될 것이다. 아황산염 감소 박테리아는 한천 을 둘러싸는 검은 색으로 바뀝니다. 가능한 C. perfringens 식민지는 검은 색과 한천에 내장될 것입니다. C. 의심 식민지 는 아황산염 감소에 대 한 긍정적인 될 것입니다 및 한천 내에 포함 된 검은 색 나타납니다. 멸균, 일회용 점안제, 한천에서 검은 식민지를 “뽑아”15 mL 원엽 튜브에서 신선한 RPM의 10 mL로 전송합니다. 한천을 관통하기 전에 점안제의 공기를 추방하는 것이 중요합니다. 플레이트 표면에 호기성 세균 성장이 조밀한 경우 멸균 셀 스크레이퍼를 사용하여 선택한 영역에서 식민지를 제거하십시오. 콜로니가 의심되는 여러 C. perfringens는 동일한 TSC 플레이트에서 별도의 RPM 배양으로 샘플링될 수 있습니다. 원두 튜브 뚜껑을 단단히 고정하고 파라핀 필름 또는 플라스틱 랩으로 감싸십시오. 37 °C에서 ON을 배양하십시오. 5. DNA 추출 ON RPM 배양을 제거하고 탁도 및 발효를 포함한 성장 징후를 검사하십시오. RPM 문화를 부드럽게 반전하여 정착된 박테리아를 분산시키고 조심스럽게 열어 보냅니다. 배양 1 mL을 미세 원심 분리관으로 옮김을 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김. 최고 속도 (약 15,000 x g)에서10 분 동안 펠렛 박테리아. 멸균 PBS 1 mL로 펠릿을 씻으십시오. 어떤 상황에서는 소화되지 않은 젤라틴이 펠릿 박테리아 위에 정착합니다. 젤라틴을 제거하려면 마이크로파이펫을 사용하여 PBS로 부드럽게 교반하여 젤라틴을 “보풀”합니다. 이것은 세균성 펠릿을 그대로 두면서 젤라틴을 “보풀”입니다. 부드러운 포부로 PBS-젤라틴 혼합물을 제거합니다. 신선한 PBS 1 mL로 나머지 세균 펠릿을 다시 일시 중단합니다. 10 분 동안 최고 속도로 재 중단 된 세균 펠릿을 원심 분리하고 조심스럽게 상판을 흡인합니다. 그람 양성 균에서 DNA를 추출하기 위해 특별히 생성 된 DNA 추출 키트 및 프로토콜을 사용하여 즉시 DNA 추출을 수행합니다 (재료 표참조). 추출된 DNA를 즉시 사용하거나 PCR 분석전까지 -20°C에서 보관하십시오. 6. PCR 지질형 검출을 통한 C. 퍼프린스 검출 문화가 C. perfringens 독소형에 대한 양성인지 확인하려면 PCR을 통해 다른 독소 유전자에 대해 추출 된 DNA를 검사하십시오.참고 : 우리는 균주 B 및 D C. perfringens를생산하는 엡실론 독소에 가장 관심이 있기 때문에, 우리는 알파, 베타, 및 엡실론 독소 유전자의 존재를 평가한다. 프라이머는 표 2에나열되어 있습니다. 16s 리보좀 DNA에 대한 프라이머는 DNA 추출 대조군으로서 사용된다. 추가프라이머는 A부터 G까지 독시타입을 테스트하는데 사용될 수 있으며, 출판된 문헌2,12,13에서찾을 수 있다. 이전에 추출한 C. perfringens DNA를 양성 대조군으로 사용하십시오. 이 컨트롤은 PCR 반응의 모든 구성 요소가 작동하는지 확인합니다. 우리는 C. perfringens 유형 B (ATCC 3626)에서 추출 한 DNA를 긍정적 인 대조군으로 사용합니다. 37°C에서 RPM에서 ATCC 3636 ON을 성장시키고 단계 5.1-5.7에 기재된 동일한 방법을 사용하여 DNA를 추출한다. 추출한 DNA를 사용할 때까지 -20°C에서 보관하십시오. 다음과 같이 PCR 조건을 설정: 3 분 동안 94.0 °C; 30s에 대한 94.0 °C; 30초의 경우 47.9°C, 1분 동안 72.0°C(35사이클에 대해 2-4단계 반복단계); 72.0 °C에서 10 분 동안. PCR 제품을 확인하려면 표준 기술을 사용하여 1.8 g/100 mL 아가로즈 젤에서 PCR 반응을 실행하십시오. 예상 PCR 제품 크기는 표 2에나열되어 있습니다. 일반적인 PCR 결과는 그림 3에표시됩니다.