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环境科学

Anreicherung und Nachweis von Clostridium perfringens Toxinotypes in Einzelhandels-Lebensmittelproben

Published: October 18, 2019
doi:
10.3791/59931
, ,
1Brain and Mind Institute,Weill Cornell Medical College

Summary

Ziel dieses Protokolls ist es, verschiedene Clostridium perfringens toxinotypes in lokal gekauften Lebensmitteln, insbesondere Epsilontoxin produzierenden Stammtypen B und D, ohne verwendung von anaeroben Kammern zu erkennen.

Abstract

Clostridium perfringens (C. perfringens) ist ein produktiver Toxinproduzent und verursacht eine breite Palette von Krankheiten bei verschiedenen Wirten. C. perfringens ist in fünf verschiedene Toxinotypen, A bis E, eingeteilt, basierend auf der Beförderung von vier Haupttoxingenen. Die Prävalenz und Verbreitung dieser verschiedenen Toxinotypen ist unteruntersucht, insbesondere ihre Verbreitung in amerikanischen Einzelhandelsnahrung. Von besonderem Interesse für uns sind die Stämme Typ B und D, die Epsilontoxin produzieren, ein extrem tödliches Toxin, das als Umweltauslöser von Multipler Sklerose beim Menschen vermutet wird. Um das Vorhandensein verschiedener C. perfringens toxinotypes in verschiedenen Lebensmittelproben zu bewerten, entwickelten wir eine einfache Methode, um diese Bakterien selektiv zu kultivieren, ohne dass ein anaerobes Behältersystem nur mit drei Kultivierungsschritten verwendet wird. Lebensmittel werden in lokalen Lebensmittelgeschäften gekauft und unter Umgebungsbedingungen ins Labor transportiert. Die Proben werden gehackt und in modifizierte Schnellperfringenmedien (RPM) geimpft und über Nacht bei 37 °C in einem versiegelten, luftdichten konischen Rohr inkubiert. Über Nacht werden Kulturen auf eine untere Schicht aus solidem Tryptose Sulfite Cycloserin (TSC) Agar geimpft und dann mit einer obersten Schicht aus geschmolzenem TSC-Agar überlagert, wodurch eine “sandwiched”, anaerobe Umgebung entsteht. Agarplatten werden über Nacht bei 37 °C inkubiert und dann auf das Auftreten schwarzer, sulfitreduzierender Kolonien untersucht. C. perfringens-verdächtige Kolonien werden mit sterilen Augentropfen aus dem TSC-Agar entfernt und in RPM geimpft und über Nacht bei 37 °C in einem luftdichten konischen Rohr subkultiviert. DNA wird aus der RPM-Subkultur extrahiert und dann über Polymerase-Kettenreaktion (PCR) auf das Vorhandensein von C. perfringens Toxingenen analysiert. Je nach Art der untersuchten Lebensmittel werden in der Regel 15–20 % der Proben positiv auf C. perfringensgetestet.

Introduction

Clostridium perfringens (C. perfringens) ist ein Gram-positives, anaerobes, sporenbildendes, stabförmiges Bakterium, das in der Umwelt allgegenwärtig ist. Diese Bakterienart trägt Gene, die für über 17 Toxine kodieren und wurde historisch gesehen in fünf Toxinotypen (A-E) charakterisiert, die auf dem Vorhandensein von vier verschiedenen Toxingenen basieren: Alpha, Beta, Epsilon und Jotatoxin (Tabelle 1)1. Kürzlich wurde vorgeschlagen, dass dieses Typisierungsschema um die Typen F und G erweitert werden muss, die das C. perfringens enterotoxin (CPE) und NetB toxin bzw.2enthalten. Es bedarf jedoch weiterer Forschung, bevor dieses Scheming-System formell akzeptiert wird. Während das Alpha-Toxin-Gen streng chromosomal lokalisiert ist, kann das CPE-Gen sowohl auf dem Chromosom als auch auf den Plasmiden gefunden werden. Im Vergleich dazu finden sich die Gene der verbleibenden Toxine auf verschiedenen unterschiedlich großen Plasmiden. Wir sind besonders an der Prävalenz von C. perfringens Typ B und D interessiert, da diese Stämme Epsilontoxin produzieren, ein extrem starkes, porenbildendes Toxin, das eine Rolle bei der Auslösung von Multipler Sklerose (MS) beim Menschen spielen soll3 ,4,5,6,7. Wie Menschen durch diese Stämme infiziert oder kolonisiert werden, ist nicht bekannt. Eine mögliche Erklärung ist der Verzehr kontaminierter Lebensmittel. Um diese Frage zu beantworten, versuchten wir, die Prävalenz verschiedener C. perfringens Toxinotypen in amerikanischen Lebensmittelproben zu bestimmen.

Das Vorhandensein von C. perfringens toxinotypes in amerikanischen Lebensmittelproben ist unteruntersucht und erfordert häufig die Verwendung von anaeroben Behältersystemen und zahlreichen Unterbaustufen8,9,10,11 . Obwohl zahlreiche Subkultivierungsschritte erforderlich sind, um gereinigte Isolate zu erhalten, kann diese Methode im Laufe der Zeit zum Verlust von Plasmiden führen12,13,14, möglicherweise den Nachweis von Plasmid-übertragenen Toxingenen beeinflussen. einschließlich des Epsilontoxin-Gens. Wir versuchten, eine einfache Methode zu entwickeln, mit weniger Unterbauschritten, um selektiv Zusätzmittel zu kultivieren, ohne anaerobe Kammern, Gläser oder Taschen zu verwenden. Kurz gesagt, Lebensmittelproben werden über Nacht (ON) in Rapid Perfringens Media (RPM) geimpft, dann in TSC-Agar “gepfert” und on inkubiert. Kolonien, die im Verdacht stehen, C. perfringens zu sein, werden dann in RPM subkultiviert und wieder ON inkubiert. DNA wird extrahiert und PCR durchgeführt, um den Genotyp zu bestimmen (Abbildung 1). Wir haben uns für RPM entschieden, da es gezeigt wurde, dass die Rückgewinnung von C. perfringens Stämmen aus Lebensmittelproben im Vergleich zu anderen Standardmedien zu erhöhen15. Darüber hinaus wurde RPM erfolgreich eingesetzt, um einen Epsilontoxin-produzierenden Typ-B-Stamm von einem MS-Patienten4zu isolieren. Wir verwenden eine modifizierte Version von RPM anstelle der ursprünglichen Version, um eine einfache DNA-Extraktion zu ermöglichen. Während diese Methode eine einfache Identifizierung von Toxingenen in Proben ermöglicht, ist es möglich, dass eine einzelne Probe mehr als ein C. perfringens toxinotype enthält. Da unsere Methode gereinigte Stämme nicht mit mehreren Reinigungsrunden isoliert, ist die Identifizierung mehrerer Toxinotypen aus einer Probe nicht möglich. Am Ende unseres Protokolls können jedoch Standardreinigungstechniken (in der Regel auf TSC-Platten oder Blutagarplatten) angewendet werden, um gereinigte Kulturen zu erreichen.

Protocol

HINWEIS: C. perfringens gilt als Biosicherheitsrisikostufe 2 (BSL2) Organismus. Obwohl nicht alle Lebensmittelproben C. perfringensenthalten, sollten alle kultivierten Proben als solche behandelt werden. Alle geeigneten Vorsichtsmaßnahmen und Personalschutzausrüstung (PSA) sollten zu jeder Zeit getragen werden. Dekontaminieren Sie das gesamte Material vor der Entsorgung. 1. Vorbereiten modifizierter RPM4,15 Kombinieren Sie 30 g/L Flüssigkeit Thioglycolat Medium, 60 g/L Gelatine, 5 g/L Pepton, 5 g/L Glukose, 5 g/L Kaliumphosphat dibasic, 3 g/L Hefeextrakt, 1,5 g/L Natriumchlorid, 0,5 g/L Eisensulfat in deionisiertem Wasser, bis gleichmäßig dispergiert. Wir machen in der Regel 1 L-Chargen. Autoklav bei 121 °C für 15 min. Auf ca. 40 °C abkühlen lassen. Sobald RPM kühl ist, fügen Sie D-Cycloserin zu einer Endkonzentration von 440 mg/L hinzu.HINWEIS: Die In-Salzkonzentrationen von D-Cycloserin gelösten D-Cycloserin können bei 50 mg/ml bei -20 °C für die spätere Verwendung gelagert werden. Aseptisch 10 ml RPM auf 15 ml konische Rohre übertragen. RPM kann in Chargen zubereitet und bei 4 °C bis zu einem Monat gelagert werden. Vor gebrauchen s/ b.: RPM auf 37 °C erwärmen. 2. Probensammlung und RPM-Inkubation Transport von Lebensmitteln ins Labor bei Umgebungstemperaturen innerhalb von 1 h. Lebensmittel können in Originalverpackungen oder sterilen Behältern transportiert werden. Wenn die Prüfung nicht sofort erfolgt, können Lebensmittel bis zur Verwendung bei -20 °C gelagert werden. Notieren Sie sich die Art der Lebensmittel und das Ursprungsland gemäß dem Verpackungsetikett, sofern verfügbar, sowie alle anderen relevanten Informationen. Ca. 1,0–2,0 g Lebensmittel entfernen und in eine sterile Petrischale oder ein gleichwertiges Umlegen bringen. Fein hacken mit einer sterilen Rasierklinge oder Skalpell. In einem 15 ml konischen Rohr in 10 ml Phosphatgepufferte Salin (PBS) einimpfen. Gut mischen. Zur Auswahl für vegetative Zellen 5 ml des PBS-Lebensmittelgemisches in ein 15 ml konisches Rohr mit 10 ml Drehzahl übertragen. Sichern Sie den Deckel fest. Zur Auswahl von Sporen die restlichen 5 ml PBS-Lebensmittelmischung bei 85 °C 15 min erhitzen und dann in ein 15 ml konisches Rohr mit 10 ml Drehzahl geben. Sichern Sie den Deckel fest. Wirbel und invertieren die Lebensmittel-RPM-Kulturen, um eine vollständige Durchmischung zu gewährleisten. Versiegeln Sie die konischen Rohre fest und wickeln Sie Deckel mit Paraffinfolie oder Plastikfolie, um eine anaerobe Umgebung zu gewährleisten. Über Nacht (ON) bei 37 °C inkubieren. Am nächsten Morgen notieren Sie trüben oder gärung in RPM-Röhren. 3. TSC “Sandwich” Beschichtung Inokulieren Sie ON RPM-Kulturen in TSC-Agar mit einer unten beschriebenen “Sandwich”-Technik (Abbildung 2). Bereiten Sie TSC Agar gemäß den Anweisungen des Herstellers vor. Bereiten Sie die Basisschicht der TSC-Platten vor, indem Sie 10 ml geschmolzenen TSC-Agar auf sterile Petrischalen übertragen und erstarren lassen. Diese können in fortgeschrittenen vorbereitet und bei 4 °C gelagert werden. Stellen Sie sicher, dass die Platten vor der Verwendung auf Raumtemperatur erwärmt werden. Für die oberste Schicht der TSC-Platte den verbleibenden geschmolzenen TSC-Agar bei 40 °C aufbewahren.HINWEIS: Obwohl der Schmelzpunkt des Agars über 85 °C liegt, erstarrt geschmolzener Agar um 32–45 °C. Rufen Sie vorsichtig die ON-RPM-Kulturen ab und übertragen Sie 100 L auf die TSC-Agarbasis. Aufgrund der Gärung können einige Kulturen unter Druck stehen. Achten Sie darauf, alle entsprechenden PSA zu tragen. Verteilen Sie das RPM-Inokulum mit sterilisierten Glasperlen oder Zellstreuer. Lassen Sie RPM 5–10 min bei Raumtemperatur in TSC-Agar “absorbiert” werden. 20 ml geschmolzenen, 40 °C TSC-Agar vorsichtig mit einer serologischen Pipette auf die Platte geben. Ersetzen Sie den Petrischalendeckel und lassen Sie den TSC-Agar bei Raumtemperatur vollständig erstarren. Die Petrischale umkehren und bei 37 °C eininkubieren. Wenn serielle Verdünnungen gewünscht werden, führen Sie Verdünnungen der ON RPM-Kulturen in frische, vorgewärmte RPM vor der Impfung in TSC-Agar durch. 4. Unterkultivierung sulfitreduzierender Kolonien Am nächsten Morgen, entfernen Sie Platten aus dem Brutkasten und untersuchen auf bakterielles Wachstum. Aerobe Bakterien können auf der Oberfläche des Agars vorhanden sein. Anaerobe Bakterien werden in den Agar eingebettet wachsen gefunden werden. Sulfitreduzierende Bakterien werden umgebende Agar schwarz. Mögliche C. perfringens Kolonien werden schwarz und in den Agar eingebettet sein. C. perfringens vermutete Kolonien werden positiv für Sulfit-Reduktion sein und wird schwarz erscheinen, eingebettet in den Agar. Mit einer sterilen, einweg-Perltropfengucke, “zupfen” die schwarzen Kolonien aus dem Agar und übertragen auf 10 ml frische RPM in einem 15 ml konischen Rohr. Es ist wichtig, dass die Luft aus der Augentropfen vor dem Piercing Agar ausgestoßen werden. Wenn es eine dichte Menge an aeroben bakteriellen Wachstum auf der Oberfläche der Platte, verwenden Sie einen sterilen Zellschaber, um Kolonien aus ausgewählten Bereichen zu entfernen. Mehrere C. perfringens vermutete Kolonien können von der gleichen TSC-Platte in separate RPM-Kulturen abgetastet werden. Fest sichere konische Rohrdeckel und in Paraffinfolie oder Plastikfolie wickeln. Ein bei 37 °C inkubieren. 5. DNA-Extraktion Entfernen Sie ON RPM Kulturen und untersuchen Sie auf Anzeichen von Wachstum einschließlich Trübung und Fermentation. Um vorsichtig Drehzahlkultur umzukehren, um alle besiedelten Bakterien zu zerstreuen und vorsichtig zu öffnen. 1 ml der Kultur in ein Mikrozentrifugenrohr übertragen. Zentrifuge mit Höchstgeschwindigkeit (ca. 15.000 x g) für 10 min Pelletbakterien. Pellet mit 1 ml sterilem PBS waschen. Unter bestimmten Umständen wird sich unverdaute Gelatine auf pelletierten Bakterien niederlassen. Um Gelatine zu entfernen, “fluff” aus Gelatine durch sanftes Rühren mit PBS mit einer Mikropipette. Dadurch wird die Gelatine “fluff-up”, während das bakterielle Pellet intakt bleibt. Entfernen Sie die PBS-Gelatinemischung mit sanfter Aspiration. Das verbleibende bakterielle Pellet mit 1 ml frischem PBS wieder aufhängen. Zentrifugieren Sie das resuspendierte Bakterielle Pellet mit Höchstgeschwindigkeit für 10 min und aspirieren Sie vorsichtig den Überstand. Führen Sie sofort die DNA-Extraktion mit einem DNA-Extraktionskit und einem Protokoll durch, das speziell für die Extraktion von DNA aus grampositiven Bakterien erstellt wurde (siehe Tabelle der Materialien). Verwenden Sie die extrahierte DNA sofort oder lagern Sie bei -20 °C bis zur PCR-Analyse. 6. Erkennung von C. perfringens über PCR-Genotypisierung Um festzustellen, ob Kulturen für C. perfringens toxinotypes positiv sind, untersuchen Sie extrahierte DNA auf verschiedene Toxingene über PCR.HINWEIS: Da wir am meisten an den Epsilontoxin produzierenden Stämmen Typ B und D C. perfringensinteressiert sind, bewerten wir das Vorhandensein der Alpha-, Beta- und Epsilontoxingene. Primer sind in Tabelle 2aufgeführt. Primer für 16s ribosomale DNA werden als DNA-Extraktionskontrolle verwendet. Zusätzliche Primer können verwendet werden, um auf Toxinotypen A bis G zu testen und können in der veröffentlichten Literatur2,12,13gefunden werden. Verwenden Sie zuvor extrahierte C. perfringens DNA als positive Kontrolle. Diese Steuerung stellt sicher, dass alle Komponenten der PCR-Reaktionen funktionieren. Als Positivkontrolle verwenden wir DNA aus C. Perfringens Typ B (ATCC 3626). AtCC 3636 ON in RPM bei 37 °C anbauen und DNA mit den gleichen Methoden extrahieren, die in den Schritten 5.1–5.7 beschrieben sind. Extrahierte DNA bis zur Anwendung bei -20 °C lagern. PCR-Bedingungen wie folgt einstellen: 94,0 °C für 3 min; 94,0 °C für 30 s; 47,9 °C für 30 s, 72,0 °C für 1 min (Wiederholungsschritte 2–4 für 35 Zyklen); 72.0 °C für 10 min. Um PCR-Produkte zu bestätigen, führen Sie PCR-Reaktionen auf einem 1,8 g/100 ml Agarose-Gel mit Standardtechniken aus. Erwartete PCR-Produktgrößen sind in Tabelle 2aufgeführt. Typische PCR-Ergebnisse werden in Abbildung 3dargestellt.

Representative Results

Mit dieser Methode testen 15–20% unserer untersuchten Lebensmittel positiv auf C. perfringens. Während die meisten Stämme positiv für den Toxinotyp A sind, haben wir sowohl Typ B als auch D in Lebensmittelproben erfolgreich nachgewiesen. In einem zuvor veröffentlichten Papier haben wir insgesamt 216 Lebensmittelproben getestet, die in New Yorker Einzelhandelsgeschäften gekauft wurden16 (Tabelle 3). Diese Proben umfassten verschiedene Fleischproben (Rind, Lamm, Schwein und Lamm), Geflügelproben (Huhn und Pute) und Fischproben (Kabeljau, Lachs, Schalentiere, Schnapper, Flunder, Tintenfisch, Tilapia, Thunfisch und verschiedene andere Fische). Auch Produktions- und Milchproben wurden getestet. Von 216 Proben, 34 (16%) waren positiv für C. perfringens. Von den 34 C. perfringens positiven Proben wurden 31 Proben (91,2%) alpha toxin, eine Probe (2,9%) Alpha-, Beta- und Epsilontoxin sowie zwei Proben (5,9%) alpha- und Epsilontoxin enthielten. Interessanterweise entdeckten wir auch, dass C. perfringens häufiger als vegetative Zellen im Vergleich zu Sporen verbreitet war. 25 Proben wurden auf das Vorhandensein von vegetativen C. perfringens Zellen oder Sporen verglichen. Sporen wurden durch hitzeschockende Proben bei 85 °C für 15 min ausgewählt. Von den 25 getesteten Proben waren 16% positiv für vegetative C. perfringens Stämme gegenüber 4% für Sporen. Dies weist darauf hin, dass es möglicherweise kostengünstiger ist, nur vegetative Zellen anstelle von beidem zu testen. Abbildung 1: Übersicht über die Prozedur.Lebensmittelproben werden gehackt und zu sterilem PBS verdünnt. Die Hälfte der PBS-Lebensmittelprobe wird in RPM geimpft, um sie für vegetative Zellen auszuwählen. Die verbleibende PBS-Lebensmittelprobe wird bei 85 °C 15 min wärmer geschockt, um vor der Impfung in RPM für Sporen auszuwählen. Kulturen werden bei 37 °C eingeschrieben und dann in TSC-Agar eingehakt. TSC-Agar wird bei 37 °C eingetaucht und schwarze, sulfitreduzierende Kulturen werden in frische Drehzahl subkultiviert. Subkultivierte RPM-Kulturen werden bei 37 °C eingeschrieben und DNA extrahiert, um Genotypisierung über PCR durchzuführen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 2: Schematische TSC-Agar-Sandwich-Technik.RPM-Medien, die die C. perfringens Bakterien enthalten, werden zwischen zwei Schichten TSC-Agar plattiert, um eine anaerobe Umgebung zu fördern. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 3: Ausgewählte PCR-Ergebnisse.Beispielbilder der Genotypisierungsergebnisse von C. perfringens aus sieben verschiedenen Arten von Lebensmitteln und eine positive Kontrolle von C. perfringens Typ B. Eine Molekulargewichtsleiter (erste Spur jedes Gels) wurde verwendet, um die Größe der PCR-Ergebnisse in Basenpaaren (bp) anzunähern. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Toxinotyp alpha Beta Epsilon Iota Cpe NetB bestehend pro + – – – – – B + + + – – – c + + – – + – D + – + – + – E + – – + + – Vorgeschlagenen f + – – – + – g + – – – – + + vorhanden- nicht vorhanden+/- kann vorhanden sein oder nicht Tabelle 1: Übersicht über Die Genotypen von C. perfringens. Ein Diagramm der Kombinationen von Toxinen, die von jedem C. perfringens toxinotype produziert werden. zielscheibe Primer-Paare Erwartetes PCR-Produkt (bp) alpha F: GCT AAT GTT ACT GCC GTT GAR: CCT CTG ATA CAT CGT GTA AG 325 Beta F: GCG AAT ATG CTG AAT CAT CTAR: GCA GGA ACA TTA GTA TAT CTT C 196 Epsilon F: GCG GTG ATA TCC ATC TAT TCR: CCA CTT ACT TGT CCT ACT AAC 655 16s RNA F: AGA GTT TGA TCC TGG CTC AR: GGT TAC CTT GTT ACG ACT T Nr. 1300 Tabelle 2: Primer und erwartete PCR-Produkte für ausgewählte Toxingene. Primer, die im PCR-Genotypisierungsschritt verwendet werden. Lebensmitteltyp Typ A Typ B Typ C Typ D C. perf + Alphatoxin positiv Alpha-, Beta- und Epsilontoxin-positiv Alpha und Beta-Toxin positiv Alpha- und Epsilontoxin positiv N N % N % N % N % N % fleisch rindfleisch 38 8 21% 1 3% 0 0% 0 0% 9 24% lamm 10 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% schweinefleisch 15 2 13% 0 0% 0 0% 0 0% 2 13% gemischt 1 1 100% 0 0% 0 0% 0 0% 1 100% zwischen- 64 11 17% 1 2% 0 0% 0 0% 12 19% geflügel küken 19 5 26% 0 0% 0 0% 0 0% 5 26% Turkei 7 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% zwischen- 26 5 19% 0 0% 0 0% 0 0% 5 19% meeresfrüchte kabeljau 4 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% gemischt 1 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% lachs 11 2 18% 0 0% 0 0% 0 0% 2 18% shelfish 32 1 3% 0 0% 0 0% 0 0% 1 3% Snapper 4 3 75% 0 0% 0 0% 0 0% 3 75% zappeln 12 4 33% 0 0% 0 0% 0 0% 4 33% Tintenfisch 4 1 25% 0 0% 0 0% 0 0% 1 25% Tilapia 21 2 10% 0 0% 0 0% 2 10% 4 19% thunfisch 3 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% andere 8 1 13% 0 0% 0 0% 0 0% 1 13% zwischen- 100 14 14% 0 0% 0 0% 2 2% 16 16% milchgeschäft kuh 3 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% ziege 4 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% milch 3 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% zwischen- 10 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% hervorholen gemüse 12 1 8% 0 0% 0 0% 0 0% 1 8% obst 1 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% kraut 3 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% zwischen- 16 1 6% 0 0% 0 0% 0 0% 1 6% gesamt 216 31 14% 1 0.50% 0 0% 2 0.90% 34 16% Tabelle 3: Prävalenz verschiedener C. perfringens toxinotypes in 216 Lebensmittelproben. Ein Beispiel für die Ergebnisse, die bei der Verwendung dieser Methode zum Testen von Einzelhandelsnahrung auf C. perfringenserzielt wurden. Diese Tabelle wurde aus dem zuvor veröffentlichten Manuskript Regan et al.16geändert.

Discussion

Hier beschreiben wir eine Methode zur Identifizierung der C. perfringens Prävalenz in Einzelhandels-Lebensmittelproben mit begrenzter Subkultivierung und ohne Verwendung eines anaeroben Kammersystems. Diese Methode verwendet eine Kombination von Techniken, um die Identifizierung von C. Perfringens aus Lebensmittelproben zu erhöhen. Durch die Verwendung einer modifizierten Version von RPM-Medien ermöglichen wir das selektive Wachstum von C. perfringens. Durch das Einstecken der geimpften Drehzahl zwischen Schichten von TSC-Agar sind wir in der Lage, anaerobe, sulfitreduzierende Bakterien zu identifizieren und zu isolieren, die für C. perfringenscharakteristisch sind. Um das Vorhandensein von C. perfringenszu bestätigen, werden Sulfit-reduzierende Kolonien in frische Drehzahl subkultiviert. Die modifizierte Version oder RPM ermöglicht es uns, leicht DNA aus Kulturen zu extrahieren, was die PCR-Bestätigung bestimmter Toxingene ermöglicht. Die Bestätigung von C. perfringens kontaminierten Lebensmittelproben kann innerhalb von drei Tagen erreicht werden.

In frühen Experimenten wurden Lebensmittelproben einfach in RPM geimpft und DNA aus ON-Kulturen extrahiert. Diese Methode führte zum Nachweis von C. perfringens in einer begrenzten Anzahl von Proben (Daten nicht gezeigt). Obwohl RPM für c. perfringens Wachstum selektiv ist, ist es nicht ausschließlich für C. perfringens Wachstum. Andere, grampositive, D-Cycolserin-resistente Bakterien können noch in RPM wachsen. Wir vermuteten, dass die Kontamination durch andere Bakterienarten unseren Nachweis von C. perfringens-Stämmen verringert haben könnte, indem die Empfindlichkeit unserer PCR-Analyse in unserer ersten ON-RPM-Kultur verringert wurde. Ein entscheidender Schritt bei der Erhöhung der Erkennung von C. perfringens war die Einbeziehung der TSC Agar “Sandwich” Technik. Dies ermöglichte es uns, für anaerobe, sulfit reduzierende Kolonien, die für C. perfringens charakteristisch sind, zu differenzieren und auszuwählen. Ein wichtiger Schritt in diesem Prozess ist es, sicherzustellen, dass die oberste Schicht des geschmolzenen TSC-Agars bei 40 °C liegt. Obwohl einige C. perfringens Stämme bei erhöhten Temperaturen (46–48 °C)15,16wachsen können, reduziert die Zugabe von geschmolzenem Agar bei erhöhten Temperaturen die Menge der wiedergewonnenen Kulturen stark, was wahrscheinlich auf den Zelltod zurückzuführen ist. .

Es gibt mehrere potenzielle Einschränkungen für diese Methode. Wie bereits erwähnt, wählt oder differenziert weder der RPM- noch der TSC-Agar ausschließlich C. perfringens, was das Wachstum anderer Bakterienarten in Lebensmittelproben ermöglicht. Dies kann die Empfindlichkeit des Assays verringern, nur für C. perfringens auszuwählen. Dies ist jedoch eine häufige Einschränkung in fast allen Kultivierungstechniken. Genotypisierung Bestätigung von gereinigten Isolaten ist die beste Methode zur endgültigen Identifizierung von C. perfringens und anderen bakterienarten. Eine weitere Einschränkung dieser Studie ist, dass wir die gereinigten Isolate nicht testen. Wir haben dies absichtlich getan, um die Menge der Subkultivierung zu begrenzen, da wiederholte Unterkultivierung befürchtet wird, um zu Plasmidverlust zu führen. Da wir nicht auf Reinheit isolieren, ist es möglich, dass mehrere C. perfringens toxinotypes in der gleichen Probe oder Subkultur vorhanden sein können. Wenn Forscher gereinigte Isolate erhalten möchten, können Standardreinigungsmethoden auf der letzten RPM-Kultur verwendet werden, die in dieser Methode beschrieben wird; dies erfordert in der Regel die Verwendung von anaeroben Kammern. Obwohl ursprünglich verwendet, um C. perfringens von Lebensmitteln zu isolieren, kann diese Methode verwendet werden, um C. perfringens aus einer Vielzahl von Quellen zu identifizieren und zu isolieren. Insbesondere ist eine solche Anwendung dieser Methode, Fäkalienproben von Menschen (oder Tieren) zu testen, die im Verdacht stehen, mit C. perfringens infiziert zu sein und die Bakterien toxinotyp, um die Infektionsquelle besser zu verstehen.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Forschung erhielt keine spezifischen Mittel aus dem öffentlichen, kommerziellen oder gemeinnützigen Sektor.

Materials

D-Cycloserine Sigma-Aldrich C6880
Dextrose Sigma Life Science D9434-250G
Disposable Transfer Pipets any brand Select one with slim tip like Thermo Scientific Disposable Transfer Pipets 137116M/EMD
DNeasy Blood & Tissue Kits Qiagen 69504 Note: numerous DNA and plasmid extractions kits were evaluated, this kit gave the most desirable results.
Dry Incubator any brand
Fluid thioglycolate medium Remel R453452
Gelatin from porcine skin Sigma Life Science G1890-500G
Individual Primers Invitrogen
Iron (II) sulfate heptahydrate Sigma Life Science F8633-250 G
Lysozyme from chicken egg white Sigma-Aldrich L6876 Needed for DNA extraction, not provided in kit
microcentrifuge tube any brand
parafilm or plastic wrap any brand
Peptone from casein and other animal proteins Sigma-Aldrich 70173-100G
Perfringens Agar Base (TSC + SFP) Oxoid CM0587 Make TSC agar according to instructions
Potassium phosphate dibasic Sigma-Aldrich P2222-100G
Sodium chloride Sigma-Aldrich S-7653
Sterile Cell Scraper any brand
Sterile cell Spreader any brand
Sterile petri dishes any brand
Supplies and equipment for gel electrophoresis any brand
table top centrifuge any brand
Taq PCR Master Mix Kit Qiagen 201443
Thermocycler for PCR reaction any brand
water bath any brand
Yeast extract Sigma-Aldrich 70161-100G
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References

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Clostridium PerfringensToxinotypesEnrichmentDetectionRetail Food SamplesEpsilon ToxinModified Rapid Perfringens Medium (RPM)D-cycloserineTryptose Sulfite Cycloserine (TSC) AgarAnaerobic CultureSpore Selection

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Anwar, Z., Regan, S. B., Linden, J. Enrichment and Detection of Clostridium perfringens Toxinotypes in Retail Food Samples. J. Vis. Exp. (152), e59931, doi:10.3791/59931 (2019).
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