자외선-C (UV-C) 손상에 응하여 1 차 마우스 안구 표면 세포/줄기 세포에 있는 산화 손상의 평가
Summary
이 프로토콜은 마우스 안구 표면 세포로부터살아있는 1차 배양에서 반응성 산소 종(ROS), 살아있는 세포 및 죽은 세포의 동시 검출을 입증한다. 2′,-7′-디클로로플루오레세테이트, 프로피듐 요오드화물 및 Hoechst 염색은 ROS, 죽은 세포 및 살아있는 세포를 각각 평가하기 위해 사용되며, 이미징 및 분석이 뒤따릅니다.
Abstract
안구 표면은 다양한 환경 적 요인으로 인해 정기적으로 마모됩니다. UV-C 방사선에 노출은 직업 건강 위험을 구성합니다. 여기에서, 우리는 UV-C 방사선에 마우스 안구 표면에서 1 차적인 줄기 세포의 노출을 보여줍니다. 반응성 산소 종 (ROS) 형성은 산화 스트레스 / 손상의 정도의 판독이다. 시험관 내 실험 환경에서는 산화 스트레스로 인해 생성된 죽은 세포의 백분율을 평가하는 것도 필수적입니다. 이 기사에서는 UV-C 노출 된 마우스의 2′,7′-Dichlorofluescececetate (DCFDA) 염색을 시연할 것이며 DCFDA 염색의 형광 이미지에 기초한 1 차적인 안구 표면 줄기 세포 및 정량화를 시연할 것입니다. DCFDA 염색은 ROS 생성에 직접적으로 해당합니다. 우리는 또한 각각 프로피듐 요오드화물 (PI) 및 Hoechst 3332와 DCFDA (ROS 양성) 및 PI 양성 세포의 백분율로 동시에 염색함으로써 죽은 세포와 살아있는 세포의 정량화를 입증합니다.
Introduction
안구 표면(OS)은 주로 각막, 래크리말 선, 마이보미안 선, 결막, 눈뚜껑 의 일부 및 신호를 변환하는 안구 의 일부의 외층 및 선 상피로 구성된 기능적 단위이다1. 투명 한 돔 모양의 각막 층망막에 빛을 초점을 맞추고 있습니다. 이러한 혈관 조직은 상피 세포, 각질 세포, 내피 세포 및 콜라겐 및 글리코사미노글리칸과 같은 세포 성분으로 구성된다2. 이 지역은 또한 대부분의 영양소를 공급하는 눈물로 배수됩니다. OS의 해부학 적 위치는 종종 밝은 빛, 미생물, 먼지 입자 및 화학 물질과 같은 다양한 가혹한 구성 요소에 노출, 외부 환경과 직접 접촉하도록 강요한다. 이 요인은 물리적 인 부상에 OS를 걸리기 쉽게하고 다양한 질병에 경향이있습니다.
산화 스트레스는 반응성 산소 종(ROS)의 생산과 내인성 항산화 방어 메커니즘 사이의 불균형으로 인해 발생한다3. ROS는 반응성 분자 및 자유 라디칼로 분류되며, 둘 다 미토콘드리아 산화 인산화를 통해 분자 산소(O2)에서유래된다4. 상기 전군은 과산화수소(H2O2), 일중항산소(1O2)와같은 비라디칼 종으로 구성되며, 후자는 수퍼옥사이드 음이온(O2-) 및 하이드록실 라디칼(• OH)과 같은 종을 포함한다. 이들 분자는 정상적인 세포 과정의 부산물이며, 이들의 역할은 신호 전이, 유전자 발현 및 숙주 방어5와같은 중요한 생리기능에 연루되어 왔다. ROS의 향상된 생산은 병원균 침습, 제노바이오틱스, 및 자외선(UV) 방사선에 의한 노출과 같은 인자에 반응하여 생성되는 것으로 알려져있다 4. ROS의 이 과잉 생산은 핵산, 단백질 및 지질과 같은 분자의 손상으로 이끌어 내는 산화 응력 에서 유래6.
UV 방사선의 가장 지배적 인 소스 인 자연 태양광은 UV-A (400-320 nm), UV-B (320-290 nm), UV-C (290-200 nm)7로구성됩니다. 파장과 스펙트럼 에너지 사이의 역 상관 관계가 보고되었습니다. 천연 UV-C 방사선은 대기에 흡수되지만 수은 램프 및 용접 기구와 같은 인공 공급원이 방출되므로 직업적 위험이 있습니다. 눈에 노출의 증상은 광각막염과 광각막결막염 을 포함8. ROS의 생산은 UV 유도 된 세포 손상을 유발하는 주요 메커니즘 중 하나입니다9. 현재 연구에서는 UV-C에 노출된 마우스 1차 안구 표면 세포/줄기 세포에서 2′,7′-디클로로디로디하이드로플루오레스세인 디아세이테인 디아세이테(DCFDA) 염색 방법을 사용하여 ROS검출을 입증합니다. 녹색 형광은 형광 현미경 검사법을 사용하여 포착되었습니다. 세포는 2개의 염료, Hoechst 33342 및 적색 프로피듐 요오드화물로 카운터-염색하였고, 살아있는 세포와 죽은 세포를 각각 염색하였다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 기술된 DCFDA 염색 방법은 UV-C 방사선으로 처리된 마우스 1차 안구 라이브 세포에서 ROS의 시각화를 가능하게 한다. 이 염색 방법의 장점은 연구원이 살아있는 세포에 대한 UV-C (3 시간 UVC 노출 후)의 즉각적인 효과와 ROS 양성의 비율에 대한 동시 열거, 죽은 세포의 동시 열거를 연구 할 수 있다는 것입니다. 더욱이, 염색 방법이 살아있는 세포에 사용됨에 따라, 세포는 UV-C 방사선의 지연된 효과…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 예네포야 연구 센터, 예네포야 (대학으로 간주)의 지원을 인정 인프라 시설에 대한.
Materials
| 2',7'-Dichlorofluorescein diacetate (DCFDA) | Sigma | D6883 | 2',7'-Dichlorofluorescein diacetate is fluorogenic probe and is permeable to cells. It is used for quantification of reactive oxygen species. |
| Cell culture dish (35 mm) | Eppendorf | SA 003700112 | Sterile dishes for culturing the cells. |
| DMEM High Glucose | HiMedia | AT007 | Most widely used cell culture media, contains 4500 mg/L of glucose. |
| Fetal Bovine Serum, EU Origin | HiMedia | RM99955 | One of the most important components of cell culture media. It provides growth factors, amino acids, proteins, fat-soluble vitamins such as A, D, E, and K, carbohydrates, lipids, hormones, minerals, and trace elements. |
| GlutMax | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Used as a supplement and an alternative to L-glutamine. It helps in improving cell viability and growth. |
| HL-2000 Hybrilinker | UVP | Hybridization oven/UV cross linker | |
| Hoechst 33342 | Sigma | B2261 | Hoechst stain is permeable to both live and dead cells. It binds to double starnded DNA irrespective of wether the cell is dead or alive. |
| Matrigel | Corning | Basement membrane matrix | |
| MEM Non-Essential Amino Acids (100X) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 11140050 | Used as a supplement to increase the cell growth and viability. |
| Penicillin-Streptomycin (Pen-Strep) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Penicillin and streptomycin is used to prevent the bacterial contamination in culture. |
| Propidium Iodide | Sigma | P4170 | Fluorescent dye which is only permeable to dead cells. It binds with DNA and helps in distinguishing between live and dead cells. |
| TryplE Express | Thermo Fisher Scientific | Gentle cell dissociation agent | |
| ZOE Fluorescent Cell Imager | Bio-rad |
References
- Gipson, I. K. The ocular surface: the challenge to enable and protect vision: the Friedenwald lecture. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 48 (10), 4391-4398 (2007).
- Sridhar, M. S. Anatomy of cornea and ocular surface. Indian Journal of Ophthalmoogy. 66 (2), 190-194 (2018).
- Betteridge, D. J. What is oxidative stress. Metabolism. 49 (2), 3-8 (2000).
- Ray, P. D., Huang, B. W., Tsuji, Y. Reactive oxygen species (ROS) homeostasis and redox regulation in cellular signaling. Cell Signaling. 24 (5), 981-990 (2012).
- Nita, M., Grzybowski, A. The Role of the Reactive Oxygen Species and Oxidative Stress in the Pathomechanism of the Age-Related Ocular Diseases and Other Pathologies of the Anterior and Posterior Eye Segments in Adults. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2016, 3164734 (2016).
- Covarrubias, L., Hernandez-Garcia, D., Schnabel, D., Salas-Vidal, E., Castro-Obregon, S. Function of reactive oxygen species during animal development: passive or active. 发育生物学. 320 (1), 1-11 (2008).
- Behar-Cohen, F., et al. Ultraviolet damage to the eye revisited: eye-sun protection factor (E-SPF(R)), a new ultraviolet protection label for eyewear. Clinical Ophthalmology. 8, 87-104 (2014).
- Izadi, M., Jonaidi-Jafari, N., Pourazizi, M., Alemzadeh-Ansari, M. H., Hoseinpourfard, M. J. Photokeratitis induced by ultraviolet radiation in travelers: A major health problem. Journal of Postgraduate Medicine. 64 (1), 40-46 (2018).
- de Jager, T. L., Cockrell, A. E., Du Plessis, S. S. Ultraviolet Light Induced Generation of Reactive Oxygen Species. Advances in Experimental Medicine and Biology. 996, 15-23 (2017).
- Degl’Innocenti, D., et al. Oxadiazon affects the expression and activity of aldehyde dehydrogenase and acylphosphatase in human striatal precursor cells: A possible role in neurotoxicity. Toxicology. 411, 110-121 (2019).
- Li, Z., et al. APC-Cdh1 Regulates Neuronal Apoptosis Through Modulating Glycolysis and Pentose-Phosphate Pathway After Oxygen-Glucose Deprivation and Reperfusion. Cellular and Molecular Neurobiology. 39, 123-135 (2019).
