تقييم الضرر التأكسدي في الخلايا السطحية الرئيسية للفأرة /الخلايا الجذعية استجابة للأضرار فوق البنفسجية-C (UV-C)
Summary
يوضح هذا البروتوكول الكشف المتزامن لأنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) والخلايا الحية والخلايا الميتة في الثقافات الأولية الحية من خلايا سطح العين الماوس. 2′, 7′-Dichloroforesindiacetate, يتم استخدام يوديد البروبيديوم, وتلطيخ Hoechst لتقييم ROS, الخلايا الميتة, والخلايا الحية, على التوالي, تليها التصوير والتحليل.
Abstract
يتعرض سطح العين للبلى العادية بسبب عوامل بيئية مختلفة. ويشكل التعرض للأشعة فوق البنفسجية – C خطرا على الصحة المهنية. هنا، نُظهر تعرض الخلايا الجذعية الأولية من سطح العين للفأر ة إلى الأشعة فوق البنفسجية-C. أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) تشكيل هو قراءة مدى الإجهاد التأكسدي / الضرر. في الإعداد التجريبي في المختبر ، من الضروري أيضًا تقييم النسبة المئوية للخلايا الميتة الناتجة عن الإجهاد التأكسدي. في هذه المقالة، سوف نبرهن على 2′,7′-Dichloroforesindiacetate (DCFDA) تلطيخ الأشعة فوق البنفسجية-C يتعرض الخلايا الجذعية الرئيسية سطح العين الماوس وقياسها على أساس الصور الفلورية من تلطيخ DCFDA. DCFDA تلطيخ يتوافق مباشرة مع جيل ROS. كما نبرهن على القياس الكمي للخلايا الميتة والحية عن طريق تلطيخ متزامن مع يوديد البروبيديوم (PI) وهويشت 3332 على التوالي والنسبة المئوية لخلايا DCFDA (ROS إيجابية) وPI الإيجابية.
Introduction
سطح العين (OS) هو وحدة وظيفية تتكون أساسا من الطبقة الخارجية والظهارة الغدية للقرنية، الغدة lachrymal، الغدة meibomian، الملتحمة، جزء من هوامش غطاء العين والداخلية التي تشير عبر الترانسدوس1. تركز طبقة القرنية الشفافة على شكل قبة الضوء على شبكية العين. يتكون هذا النسيج اللاوعي من مكونات خلوية مثل الخلايا الظهارية والخلايا القرنية والخلايا الانائية والمكونات الخلوية مثل الكولاجين وجليكوزامينوجليكان2. يتم استنزاف المنطقة من الدموع التي توفر أيضا معظم المواد الغذائية. الموقع التشريحي لنظام التشغيل يجبرها على أن تكون على اتصال مباشر مع البيئة الخارجية، وغالبا ما يعرضها لمختلف المكونات القاسية مثل الضوء الساطع والميكروبات وجزيئات الغبار والمواد الكيميائية. هذا العامل يهيئ نظام التشغيل للإصابات الجسدية ويجعلها عرضة لمختلف الأمراض.
يحدث الإجهاد التأكسدي بسبب اختلال التوازن بين إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) وآليات الدفاعات المضادة للأكسدة الذاتية3. يتم تصنيف ROS إلى جزيئات تفاعلية وجذور حرة ، وكلاهما مشتق من الأكسجين الجزيئي (O2)من خلال فوسفوريل الأكسدة الميتوكوندريا4. تتكون المجموعة السابقة من أنواع غير جذرية مثل بيروكسيد الهيدروجين (H2O2)، الأكسجين المنفرد(1O2)، ويشمل هذا الأخير أنواعًا مثل أنيونات أكسيد فائق (O2–) ، وجذور الهيدروكسيل(•OH) ، من بين أمور أخرى. هذه الجزيئات هي المنتجات الثانوية للعمليات الخلوية العادية وأدوارها قد تورطت في وظائف فسيولوجية هامة مثل نقل الإشارة ، والتعبير الجيني ، والدفاع المضيف5. ومن المعروف أن إنتاج معزز من ROS يتم إنشاؤه استجابة لعوامل مثل غزو مسببات الأمراض ، xenobiotics ، والتعرض للأشعة فوق البنفسجية (UV)4. هذا الإفراط في إنتاج ROS يؤدي إلى الإجهاد التأكسدي الذي يؤدي إلى تلف الجزيئات مثل الأحماض النووية والبروتينات والدهون6.
تتكون أشعة الشمس الطبيعية، المصدر الأكثر انتشارًا للأشعة فوق البنفسجية، من الأشعة فوق البنفسجية (400-320 نانومتر)، والأشعة فوق البنفسجية-B (320-290 نانومتر)، والأشعة فوق البنفسجية-C (290-200 نانومتر)7. وقد أبلغ عن وجود ارتباط عكسي بين الطول الموجي والطاقات الطيفية. وعلى الرغم من أن الغلاف الجوي يمتص الأشعة فوق البنفسجية – C الطبيعية، فإن المصادر الاصطناعية مثل مصابيح الزئبق وأدوات اللحام تنبعث منها، وبالتالي تشكل خطراً مهنياً. أعراض التعرض للعيون تشمل التهاب الكرات الضوئية والتهاب الكظر الملتحمة8. إنتاج ROS هي واحدة من الآليات الرئيسية لإلحاق الأشعة فوق البنفسجية الناجمة عن الضرر الخلوي9. في الدراسة الحالية، ونحن نبرهن على الكشف عن روس باستخدام 2′,7′-ديكلوروديهيدروفلورسين diacetate (DCFDA) طريقة تلطيخ في خلايا سطح العين الأولية الماوس / الخلايا الجذعية المعرضة للأشعة فوق البنفسجية-C. تم التقاط الفلورية الخضراء باستخدام المجهر الفلوري. وكانت الخلايا ملطخة بصبغتين، هما Hoechst 33342 ويوديد البروبيديوم الأحمر، لتلطيخ الخلايا الحية والميتة، على التوالي.
Protocol
Representative Results
Discussion
طريقة تلطيخ DCFDA الموصوفة هنا تمكن من تصور ROS في خلايا حية العين الأولية الماوس تعامل مع الأشعة فوق البنفسجية-C. ميزة طريقة تلطيخ هذه هو أنه يسمح أيضا للباحثين لدراسة الآثار الفورية للأشعة فوق البنفسجية -C (3 ساعات بعد التعرض UVC) على الخلايا الحية وتعدادها في وقت واحد لنسبة إيجابية ROS، وكذلك، ال…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويعترف أصحاب البلاغ بالدعم المقدم من مركز ينبويا للبحوث، ينبويا (الذي يعتبر جامعياً) لمرافق الهياكل الأساسية.
Materials
| 2',7'-Dichlorofluorescein diacetate (DCFDA) | Sigma | D6883 | 2',7'-Dichlorofluorescein diacetate is fluorogenic probe and is permeable to cells. It is used for quantification of reactive oxygen species. |
| Cell culture dish (35 mm) | Eppendorf | SA 003700112 | Sterile dishes for culturing the cells. |
| DMEM High Glucose | HiMedia | AT007 | Most widely used cell culture media, contains 4500 mg/L of glucose. |
| Fetal Bovine Serum, EU Origin | HiMedia | RM99955 | One of the most important components of cell culture media. It provides growth factors, amino acids, proteins, fat-soluble vitamins such as A, D, E, and K, carbohydrates, lipids, hormones, minerals, and trace elements. |
| GlutMax | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Used as a supplement and an alternative to L-glutamine. It helps in improving cell viability and growth. |
| HL-2000 Hybrilinker | UVP | Hybridization oven/UV cross linker | |
| Hoechst 33342 | Sigma | B2261 | Hoechst stain is permeable to both live and dead cells. It binds to double starnded DNA irrespective of wether the cell is dead or alive. |
| Matrigel | Corning | Basement membrane matrix | |
| MEM Non-Essential Amino Acids (100X) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 11140050 | Used as a supplement to increase the cell growth and viability. |
| Penicillin-Streptomycin (Pen-Strep) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Penicillin and streptomycin is used to prevent the bacterial contamination in culture. |
| Propidium Iodide | Sigma | P4170 | Fluorescent dye which is only permeable to dead cells. It binds with DNA and helps in distinguishing between live and dead cells. |
| TryplE Express | Thermo Fisher Scientific | Gentle cell dissociation agent | |
| ZOE Fluorescent Cell Imager | Bio-rad |
References
- Gipson, I. K. The ocular surface: the challenge to enable and protect vision: the Friedenwald lecture. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 48 (10), 4391-4398 (2007).
- Sridhar, M. S. Anatomy of cornea and ocular surface. Indian Journal of Ophthalmoogy. 66 (2), 190-194 (2018).
- Betteridge, D. J. What is oxidative stress. Metabolism. 49 (2), 3-8 (2000).
- Ray, P. D., Huang, B. W., Tsuji, Y. Reactive oxygen species (ROS) homeostasis and redox regulation in cellular signaling. Cell Signaling. 24 (5), 981-990 (2012).
- Nita, M., Grzybowski, A. The Role of the Reactive Oxygen Species and Oxidative Stress in the Pathomechanism of the Age-Related Ocular Diseases and Other Pathologies of the Anterior and Posterior Eye Segments in Adults. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2016, 3164734 (2016).
- Covarrubias, L., Hernandez-Garcia, D., Schnabel, D., Salas-Vidal, E., Castro-Obregon, S. Function of reactive oxygen species during animal development: passive or active. 发育生物学. 320 (1), 1-11 (2008).
- Behar-Cohen, F., et al. Ultraviolet damage to the eye revisited: eye-sun protection factor (E-SPF(R)), a new ultraviolet protection label for eyewear. Clinical Ophthalmology. 8, 87-104 (2014).
- Izadi, M., Jonaidi-Jafari, N., Pourazizi, M., Alemzadeh-Ansari, M. H., Hoseinpourfard, M. J. Photokeratitis induced by ultraviolet radiation in travelers: A major health problem. Journal of Postgraduate Medicine. 64 (1), 40-46 (2018).
- de Jager, T. L., Cockrell, A. E., Du Plessis, S. S. Ultraviolet Light Induced Generation of Reactive Oxygen Species. Advances in Experimental Medicine and Biology. 996, 15-23 (2017).
- Degl’Innocenti, D., et al. Oxadiazon affects the expression and activity of aldehyde dehydrogenase and acylphosphatase in human striatal precursor cells: A possible role in neurotoxicity. Toxicology. 411, 110-121 (2019).
- Li, Z., et al. APC-Cdh1 Regulates Neuronal Apoptosis Through Modulating Glycolysis and Pentose-Phosphate Pathway After Oxygen-Glucose Deprivation and Reperfusion. Cellular and Molecular Neurobiology. 39, 123-135 (2019).
