루시퍼라제-형광 리포터 인플루엔자 바이러스 감염 의 실시간 이미징 및 정량화

마우스를 관련시키는 모든 프로토콜은 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 및 로체스터 대학, 의학 및 치과 의과 대학에 기관 생물 안전위원회 (IBC)에 의해 승인되었습니다. 동물에서 수행 된 모든 실험은 국가 연구위원회58의실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 가이드의 권장 사항을 따릅니다. 로체스터 대학의 의학 및 치과 대학의 실험실 동물 의학 시설 의학과는 실험실 동물 관리 (AALAC) 국제 및 연방 및 주 법과 국립 보건원(NIH) 정책을 준수해야 합니다. 마우스와 함께 작업할 때 적절한 개인 보호 장비(PPE)가 필요합니다. 각 기관에서 이 원고에 설명된 실험을 수행할 때 유사한 정책 및 요구 사항을 구현해야 합니다. 1. 작은 척추 동물의 사용 5~7주 된 암컷 BALB/c 마우스를 구입하고 특정 병원균이 없는 조건하에서 동물 보호 시설에서 유지하십시오. 결정된 시설에 도착한 마우스는 동물이 새로운 환경에 적응할 수 있도록 4-5일 동안 휴식을 취하십시오. IACUC 프로토콜에 따라 케이지당 최대 5개의 마우스를 배치합니다.참고: 실험 결론에서, 동물이 죽임을 확인하기 위해, 마우스는 두 번째 물리적 인 방법이어야한다는 점을 고려하여 두 개의 승인 된 절차를 사용하여 안락사되었다. 본 연구에서, BIRFLU 및 생체 내 이미징을 이용한 마우스 감염 후, 동물은 2,2,2-트리브로모에탄올(TBE)의 치명적인 용량으로 안락사되고, 우리가 이전에 나타낸 바와 같이 물리적 이차 적인 방법으로 간 정맥을 절단하여23. 2. 생물 안전성 참고: 이 원고에서, BIRFLU는 일반적인 마우스 적응 실험실 IAV 균주23,32,33,56인인플루엔자 A/푸에르토리코/08/34 H1N1(PR8)의 중추에서 생성되었다. 바이러스는 앞서 설명한 플라스미드 기반 역유전학 접근법 및 생성에 대한 완전한 설명을 사용하여 생성되었으며, BIRFLU의 생체외 및 생체내 특성화는 당사의 최근 간행물55에서확인할 수 있다. IAV 감염 (시험관 내 또는 생체 내)을 관련시키는 모든 절차는 생물 안전 성 수준 (BSL)-2 조건 하에서 생물학적 안전 캐비닛에서 수행되었다. 주의 사항: 적절한 생물 안전 성 수준은 생물 안전 성 위험 평가에 따라 결정되어야합니다. 생물 안전 위험 평가 수행 및 효과적인 생물 안전 억제 확립에 대한 추가 정보는 실험이 수행될 기관과 상의해야 합니다. 모든 실험 절차를 수행하기 전과 후에 70% 에탄올 또는 이산화염소 소독제로 생물 안전 성 캐비닛을 청소하십시오. 마우스 작업의 경우 모든 해부 물질 (가위, 해부 집게 등)과 Dounce 균질화제를 사용 전후에 살균하십시오. 적절한 IBC 및 IACUC 지침에 따라 절차 중에 생산된 모든 생물학적 물질을 폐기하십시오. 3. 비르플루의 체외 특성화 (그림 2) 참고: 모든 버퍼 및 미디어 컴포지션은 표 1을 참조하십시오. 형광에 의한 단백질 발현 분석 (그림2A)및 간접 면역 형광 (그림2B) 감염 1일 전, 매딘-다비 개 신장(MDCK)을 함유한 종자 24-웰 플레이트를 조직 배양 배지에서 상피 세포(1 x 105 세포/well, 삼중)로 하고 5% CO2로 37°C 인큐베이터에서 플레이트를 유지한다. 모의 감염 및 BIRFLU 감염 세포 모두에서 선택된 모든 항체를 평가하기에 충분한 우물을 준비합니다.참고: 우리는 바이러스 성 감염을 시작하기 전에 단층을 확인하기 위해 가벼운 현미경으로 세포를 시각화하는 것이 좋습니다. 감염 시점까지 MDCK 세포의 90% 동체층이 권장됩니다. 감염 매체에서 WT 또는 BIRFLU IAV의 희석을 준비하고 감염 매체의 최종 부피에서 세포 당 0.1 플라크 형성 단위 (PFU)의 감염 (MOI)의 복합성으로 시드 된 MDCK 세포를 감염시. 3.1.1단계에서 조직 배양배지를 제거하고 1x 인산완충식염수(PBS)로 MDCK 세포를 2회 세척한다. 3.1.2에서 바이러스 희석을 MDCK 세포에 추가하고 바이러스 흡착을 허용하기 위해 실온에서 1 시간 동안 흔들리는 플랫폼에 플레이트를 놓습니다.참고: 모의 감염 세포는 바이러스가 없는 경우에만 감염 매체로 배양됩니다. 바이러스 흡착 후(단계 3.1.3), 흡인에 의해 바이러스 성 접종을 제거하고 TPCK 처리 트립신의 1 μg/mL을 포함하는 감염 후 매체의 1 mL을 각각 잘 추가한다. 33°C에서 5%CO2 가습 인큐베이터에서 18시간 동안 세포를 배양한다. 감염 의 18 시간 후, 24 웰 플레이트 (3.1.4)에서 조직 배양 상판을 제거하십시오. 실온에서 20 분 동안 0.25 mL / 고정 / 투과 용액으로 세포를 수정하고 투과하십시오.참고: 포름알데히드 노출을 방지하기 위해 연기 후드에 고정/투과 솔루션을 준비합니다. 3.1.5 단계에서 고정 / 투과 용액을 제거하고 1 x PBS로 세포를 두 번 씻고 실온에서 1 시간 동안 차단 용액을 0.25 mL / 웰로 세포를 배양하십시오.참고: 다음 단계로 진행하거나 밤새 4°C에서 차단 용액에 세포를 저장한다. 차단 용액(단계 3.1.6)을 제거하고 IAV 핵단백질, NP(HB-65) 또는 NLuc에 대한 토끼 폴리클로날 항체(pAb)의 1:1,000 희석에 대해 마우스 단일클론 항체(MAb)의 0.25 mL/well(1 μg/mL)을 추가합니다(재료 표참조), 둘 다 항체 희석 액 (1x PBS, 2.5 % BSA)에서 희석하고 37 °C에서 1 시간 동안 세포를 배양합니다. 3.1.7 단계에서 1 차 항체를 제거하고 세포를 1 x PBS로 세 번 세척하고 텍사스 적색 공액 항 마우스 또는 항 토끼 이차 항체의 0.25 mL / 웰로 배양하십시오 (재료 표참조) 항체에서 1 :200 희석 희석 용액.참고: 세포 핵은 동일한 이차 항체 용액에 0.5 μg/mL의 4′,6′-디아미디노-2-페니린들레(DAPI)를 첨가하여 동시에 염색될 수 있다. 암흑에서 37°C에서 1시간 동안 세포를 배양한다. 다른 형광단과 공액된 다른 이차 항체가 사용될 수 있다. 이차 항체 및 DAPI를 3.1.8단계에서 제거하고, 세포를 1x PBS로 3회 세척한다. 세척 후, 0.25 mL/well 의 1x PBS에 세포를 둡니다. 적절한 형광 필터를 사용하여 감염된 세포로부터 금성 및 Nluc 리포터 발현 및 NP를 검출하기 위해 형광 현미경의 단계에 플레이트를 놓습니다. 형광 현미경 (20 배배)를 사용하여 이미지를 캡처하고 이미지 편집 소프트웨어를 사용하여 병합 (그림2A,B). Nluc 활성(도2C)및 바이러스 복제(도2D)를분석한다. 감염 1일 전, MDCK 세포(2 x 105세포/well, 삼중항)를 함유한 시드 12-웰 플레이트는 5% CO2를 가진 37°C 인큐베이터에서 조직 배양 배지를 사용하여 감염 시까지 약 90% 수렴에 도달한다.참고: 감염 전에 현미경으로 세포를 확인하여 MDCK 세포의 단층을 확인하십시오. 감염의 날은 0.5 mL/well에서 0.001 PFU의 MOI로 삼중질로 MDCK 세포(단계 3.2.1.)를 감염시키기 위해 감염 매체에서 WT 및 BIRFLU 바이러스의 희석을 준비한다. 조직 배양 배지를 제거하고 1x PBS로 MDCK 세포를 두 번 세척합니다. MDCK 단층체에 바이러스 희석을 추가하고 흔들 플랫폼에서 1 시간 동안 실온에서 바이러스 흡착을 허용합니다. 바이러스 흡착 후, 바이러스 접종을 제거하고 TPCK 처리 트립신의 1 μg/mL을 포함하는 감염 후 매체의 1.5 mL를 각각 잘 추가합니다. 감염된 세포를 33°C에서 5%CO2 가습 인큐베이터에 인큐베이션하고 3.2.4단계에서 지시된 시점에서 상피제를 수집한다. 24, 48, 72, 및 96h 포스트 감염(p.i.)에서 각 웰로부터 조직 배양 상급제의 150 μL을 수집하고 샘플을 -80°C에서 미세원심분리튜브에 저장하여 Nluc 검역및 바이러스 적정을 수행하였다. Nluc 활동 분석 을 수행 하려면 제조업체의 표시를 따르십시오. 먼저, -80°C(단계 3.2.4)에 저장된 조직 배양 상상을 얼음 위에 해동한다.참고: 제조업체의 권장 사항을 참조하고 필요한 경우 분석방법을 최적화하십시오. 희석 완충액으로 Nluc 기판을 1:50 희석하여 루시퍼라아제 분석 용액(재료 표참조)을 준비한다. 루시퍼라아제 분석법을 위한 백색 평바닥 96-well 마이크로플레이트에서, 25 μL의 루시퍼라아제 분석액을 수집된 조직 배양 상수 샘플의 10~25 μL과 혼합한다. 발광계(도2C)를사용하여 발광을 측정하기 전에 2-3분 동안 혼합물을 배양하였다.참고: 조직 배양 에 있는 감염성 바이러스 입자의 존재는 앞서 설명한 바와 같이 형광 면역 초점 분석 (금성) 또는 간접 면역 형광 (바이러스 성 항원 염색)에 의해 결정된다23,32, 33,56. 바이러스 적정 을 하루 전에, 96 웰 플레이트에 종자 MDCK 세포 (2 x 104 세포 / 잘, 삼중)조직 배양 배지와 세포가 5 % CO2와 함께 37°C에서 설정 인큐베이터에서 감염의 시간에 의해 90 % 합류에 도달 할 수 있도록. 얼음 상에서 해동시킨 조직 배양 상급 샘플을 사용하였다(단계 3.2.4.). 새로운 96 웰 플레이트의 각 웰에 감염 배지 90 μL을 추가한 다음 해동된 조직 배양 상판(단계 3.2.4)의 10 μL을 제1 웰(행 A)에 추가합니다. 멀티채널 파이펫을 사용하여 10 μL을 A행에서 행 B로 혼합하고 전송합니다.참고: 이 절차는 마지막 행(H)까지 반복되어야 합니다. 우리는 바이러스 적당의 정확한 측정을 위해 삼중 항적에 바이러스 적정을 수행하는 것이 좋습니다. 96웰 플레이트(단계 3.2.7)에서 MDCK 세포로부터 조직 배양 배지를 제거하고 1x PBS로 2회 세척한다. MDCK 세포를 함유하는 96웰 플레이트에서 각각의 웰에 바이러스 희석(단계 3.2.8)을 함유하는 복제본 96웰 플레이트의 상피 희석액의 50 μL을 첨가한다. 바이러스 흡착을 허용하기 위해 실온에서 1 시간 동안 흔들 플랫폼상에서 96 웰 플레이트를 배양합니다. 바이러스 흡착 후, 접종을 제거하고 TPCK 처리 트립신의 1 μg / mL을 포함하는 감염 후 매체의 100 μL / 웰을 추가하십시오. 5% CO2를 가진 33°C 인큐베이터에서 12시간동안 감염된 세포를 배양한다. BIRFLU는 금성을 표현하기 때문에, 감염된 세포의 수는 형광 현미경을 사용하여 직접 계산될 수 있습니다. 대안적으로, 바이러스 역가는 바이러스 성 단백질23,56,57,59에대하여 항체를 사용하여 상술한 바와 같이 간접 면역형광에 의해 결정될 수 있다. 후자의 경우, 섹션 4.4에 기재된 바와 같이 안티 NP mAb HB-65를 사용하여 세포 및 얼룩을 고치고 퍼메아빌화하는 것을 진행한다. 수식을 사용하여 형광 형성 단위(FFU)/mL의 수를 계수하여 바이러스 역가를 결정합니다: ((FFU 수 x20 x 1/희석(도 2D). 4. 비르플루의 생체 내 특성화(그림3 및 그림4) 마우스 감염참고: 마우스의 비강 내 감염은 앞서 설명한대로 23을수행하였다. 감염의 마우스 모델을 사용하여 생체 내 IAV 감염의 보다 상세한 프로토콜을 위해, 우리는 이전 간행물23과관련된 비디오를 보는 것이 좋습니다. 이 섹션에서는 BIRFLU를 가진 마우스 감염에 필요한 단계만 요약합니다. 마우스의 건강과 전반적인 외모를 평가하기 위해 마우스를 검사합니다. BIRFLU의 희석을 1x PBS로 준비하여 총 부피 30 μL/마우스에서 BIRFLU의 1 x 106 PFU로 마우스를 접종합니다. 마우스 가 접종 될 때까지 얼음에 바이러스를 유지합니다.참고: 모의 감염 (1x PBS) 마우스는 화상 진찰을 위한 내부 통제로 필요합니다. BIRFLU에 감염된 동물과 는 다른 케이지에 모의 감염된 마우스를 놓습니다. 5-7주 된 암컷 BALB/c 마우스를 복부 오른쪽의 2/3에 바늘을 삽입하여 트리브로모에탄올(TBE)의 240-250 mg/kg으로 신상으로 마취시. 그런 다음 마우스를 케이지로 되돌리고 약 5분 동안 기다립니다.참고: 주 사용 진정 제는 생체 내에서 인플루엔자 감염에 대 한 흡입 된 진정 제를 통해 권장 됩니다., 후자는 기도 상피에 의해 바이러스의 행동 및 통풍 구 를 수정할 수 있습니다. 더욱이, 그(것)들은 또한 폐의 현지 면역 반응에 영향을 미치고 감염된 마우스의 생체 내 화상 진찰을 방해할 수 있습니다. 마지막으로, 흡입된 진정제는 감염한 동물의 생체 내 화상 진찰을 위한 문제가 될 효력의 기간을 감소시켰습니다. 제조된 BIRFLU 희석의 30 μL로 마우스를 내로 접종하였다. 마우스가 케이지로 되돌리기 전에 제대로 호흡하고 있는지 확인합니다. BIRFLU에 감염된 마우스의 생물 발광 모니터링 (그림4A)참고: 이 원고 기자발현에서 은루크 또는 비너스의 발현과 BIRFLU에 감염된 마우스의 폐에서의 바이러스 복제는 감염 후 3일에 결정된다. 그러나, 생물 발광 화상 진찰의 본질은 각 실험 적인 시간 점 동안 그(것)들을 안락사할 필요 없이 개별 BIRFLU 감염한 동물에 있는 Nluc 표현의 반복한 감시를 허용합니다. 이소플루란 마취 매니폴드가 있는 생체 내 이미징 시스템은 기재된 실험 절차를 수행하는 데 필요합니다. 이미지 수집 및 데이터 분석에 사용되는 이미징 기기 및 이미지 소프트웨어에 대한 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오. 생물 발광 신호를 개선하기 위해 마우스 가슴을 면도. 이미징 소프트웨어를 열고 초기화를누릅니다. 그런 다음 이미징 모드를 생물 발광으로 설정, 자동 저장, 자동 노출 시간, 필터 열기 등을 포함하여 사용할 매개 변수를 설정합니다. 기계가 완전히 초기화되면 이소플루란 마취 시스템을 켭니다. 마취 실에 동물을 놓습니다. 마우스는 산소 가스와 기화 된 1-2 % 이소플루란의 혼합물로 동시에 가볍게 마취됩니다. 일단 마우스가 마취되면, 22 G 바늘을 가진 주사기를 사용하여 레트로 궤도 경로를 통해 1x PBS (최종 부피 100 μL/마우스)에서 1:10 희석된 Nluc 기질(재료 표참조)을 투여한다. Nluc 시약 투여 직후, 이미징 기구에 동물을 가슴이 위로 향하고 매니폴드 콘 내부에 주전자를 두어 이미징 중에 동물을 마취상태로 유지합니다. 이미저 문을 닫은 직후 소프트웨어 프로그램(그림4A,상단)에서 획득을 클릭합니다. 이미징 후, 마우스를 케이지로 돌려 완전히 회복하고 이소플루란 기화기를 끌 때까지 모니터링합니다. 이어서, 마우스 폐의 생체내 영상을 진행하여 비너스 리포터 유전자 발현을 평가하였다(섹션 4.3). 이미징 소프트웨어 도구를 사용하여 획득한 생물 발광 데이터를 분석합니다. 도구 ROI (관심 영역)를 활용하여 특정 신호를 지정하고 관심 영역 (일반적으로 가슴 주위)에서 플럭스 측정을 수행합니다 (그림4A, 아래). ROI 모양은 관련이 없지만 일반적으로 전체 신호 확산 영역을 캡처하는 것이 좋습니다. 측정을클릭합니다. 광자에서 생물 발광을 평가하는 것은 다른 파라미터 또는 이미징 기기에서 제공하는 출력 측정과 비교할 수 있는 절대 적인 광자 방출 측정을 제공하기 때문에. BIRFLU에 감염된 마우스의 형광 분석(그림 3 및 그림 4B) 앞서 설명한바와같이 생체내 이미징 후 마우스 폐를 수집한다 23. 간단히, TBE의 치명적인 복용량으로 마우스를 안락사 (500 mg/kg). 절개 부위를 70 % 에탄올로 소독하십시오. 메스로 흉골에서 복부 기저부로 절개 한 다음 절개 아래에서 가위로 옆으로 자른다. 다음으로, 동물을 출혈시키기 위해 간 정맥(제2 물리적 안락사 방법)을 잘라낸다.참고: 화상 진찰 도중 높은 배경 신호를 피하기 위하여는, 폐에 있는 혈액의 양을 극소화하는 것이 중요합니다 (아래 참조). 등도 의 자세로 마우스를 놓고, 흉막을 잘라 늑골 케이지를 열고 가위를 사용합니다. 그 후, 집게로 폐를 부드럽게 잡고 있는 동안 기관의 끝을 가위로 잘라서 폐를 제거하십시오. 1x PBS의 2 mL로 6 웰 플레이트에 폐를 놓고 1 x PBS로 폐를 세 번 씻습니다.참고: 시료 간의 오염을 방지하려면 각 동물 간에 해부 도구를 청소하고 소독하십시오. 이미지 수집 소프트웨어를 클릭하여 초기화를 시작하고 이미징 모드를 형광으로 설정, 자동 저장, 자동 노출 시간, 여기(500nm) 및 방출(540nm) 필터를 포함한 이미징 매개변수를 설정합니다. 기계가 초기화되면 폐를 검은 색 배경 트레이에 놓고 조직이 서로 분리되도록하고 트레이를 이미저에 소개한 다음 이미저 문을 닫은 후 이미징 시스템 프로그램에서 획득을 클릭합니다. 그림 4B,상단). 이미징 후, 조직을 즉시 제거하고 시료가 같은 날 처리되는 경우 얼음 (4 °C)에 저장; 또는 시료가 나중에 다른 날에 처리될 경우 – 80 °C에 저장하기 전에, 신속하게 동결 튜브와 드라이 아이스에. 이미지 처리를 위해 ROI 도구를 선택하고 각 개별 폐 주위에 ROI를 그립니다. 측정을클릭합니다. 이어서, 생성된 평균 복사 효율 측정을 사용하여, 모의 감염된 마우스로부터 값을 뺍니다(도4B,하단).참고: BIRFLU의 경우 Nluc 및 금성 발현 수준과 신호 분포의 양호한 상관 관계가 있습니다. 따라서, 동일한 동물로부터 Nluc(전체 마우스) 및 금성(폐) 발현을 분석하고, 동일한 배향을 유지하는 것이 중요하다. 마우스 폐에서 BIRFLU 복제의 평가 (그림3 및 그림 4C) 앞서 설명한 바와 같이 플라크 분석에 의한 바이러스 적정을 위한 마우스 폐를 균질화하는23. 폐를 차가운 감염 매체 1 mL로 Dounce 균질화제에 넣습니다. 완전히 분해 될 때까지 실온에서 1 분 동안 유봉으로 폐를 균질화하고 4 °C의 멸균 튜브에 샘플을 저장합니다. 샘플을 300 x g에서 10 분 동안 원심 분리하고 멸균 튜브에서 상류를 수집합니다. 같은 날에 사용하거나 -80 °C에서 동결하여 나중에 바이러스 성기를 평가하기 위해 샘플을 얼음에 보관하십시오.참고: 새로운 Dounce 균질화는 각 폐 샘플에 사용되어야합니다. 플라크 분석, 바이러스 적정을 수행하기 전날, 조직 배양 배지에서 MDCK 세포(5 x 105 세포/웰)를 가진 종자 6웰 플레이트를 수행하였다. 세포를 37°C에서 5% CO2로 밤새 배양하여 다음날 90% 합류에 도달합니다. 감염 전에 세포가 가벼운 현미경으로 단층을 형성하는지 확인하십시오. 감염 매체에서 균질화된 샘플(단계 4.4.1)으로부터 상급자의 1:10 직렬 희석을 준비한다. 감염 매체의 540 μL로 microcentfuge 튜브를 준비하고, 균질화된 폐 샘플에서 60 μL을 첫 번째 튜브에 추가하고, 위아래로 파이펫팅하여 혼합한 다음 새로운 팁을 사용하여 다음 튜브로 60 μL을 옮김을 옮김을 옮김을 넣습니다. 이 직렬 희석 프로세스를 마지막 희석까지 반복합니다.참고: 우리의 경험에서 7 희석은 감염된 마우스의 폐에서 플라크 분석에 의해 바이러스 성 역가를 결정하기에 충분하다. MDCK 세포(단계 4.4.3)를 1x PBS로 2회 세척하고 연속적으로 희석된 시료의 500 μL을 6웰 플레이트에서 각각 잘 이송한다. 플레이트를 흔들 플랫폼에 놓고 실온에서 1 시간 동안 바이러스 흡수가 발생할 수 있습니다. 1 시간 의 바이러스 흡수 후, 바이러스 접종을 제거하고, TPCK 처리 트립신1 μg / mL을 포함하는 오버레이 배지의 2 mL / well을 추가한 다음 3 일 동안 5 %CO2 미만의 33 °C에서 세포를 배양하십시오. 감염된 세포(4.4.6단계)를 실온에서 1x PBS에서 2시간 동안 1mL/웰에 희석한 후, 중첩 매체를 조심스럽게 제거하고 각 우물에 1mL의 1mL를 추가합니다. 금성의 시각화를 위해 형광 검출을 위한 이미징 시스템으로 6웰 플레이트를 이미지화합니다.참고: 바이러스 성 플라크는 이미지 편집 소프트웨어를 사용하여 색칠 할 수 있습니다 (재료 표참조). Nluc 발현을 평가하기 위해, 항-Nluc pAb를 사용하여 면역 염색을 하여 바이러스 성 플라크를 시각화한다. 이를 위해 1x PBS를 제거하고 실온에서 15 분 동안 0.5 mL / 웰의 투과 솔루션을 사용하여 세포를 투과합니다. 투과 용액을 제거하고 1 x PBS로 세포를 세 번 씻고 실온에서 1 시간 동안 차단 용액0.5 mL / 웰로 차단하십시오. 4.4.9 단계에서 차단 용액을 제거하고 37 °C에서 1 시간 동안 희석 용액에서 1:1,000을 희석 한 pAb 항 Nluc의 0.5 mL / well로 세포를 배양합니다. Nluc 표현 플라크의 시각화에 대한 제조업체의 권고에 따라 ABC 알칼리성 포스파타제 키트 및 DAB 퍼옥시다아제 기판 키트를 사용합니다. 간단히, 1x PBS로 4.4.10에서 세포를 세 번 세척하고 37 °C에서 1 시간 동안 생체 용 항 토끼 이차 항체의 0.5 mL / 웰로 배양하십시오. 이차 항체를 제거하고, 세포를 1x PBS로 3회 세척하고, 37°C에서 1시간 동안 ABC 용액으로 배양한다. 1x PBS로 세포를 세 번 세척하고 DAB HRP 기판 키트로 바이러스 성 플라크를 시각화합니다. 종래의 스캐너를 사용하여 면역 염색된 플라크를 스캔합니다.참고: 면역 염색을 위한 그밖 유사한 키트는 이용될 수 있었습니다. 실온에서 1 시간 동안 크리스탈 바이올렛 용액으로 바이러스 플라크를 염색하십시오. 크리스탈 바이올렛을 버리고, 접시를 물로 세 번 씻고, 접시를 건조시키고, 접시를 다시 스캔하십시오. 바이러스 성기를 결정하려면 크리스탈 바이올렛 염색 후 드러난 플라크를 계산하십시오. 기존의 스캐너를 사용하여 플라크를 스캔합니다. mL당 플라크 형성 단위(PFU)(PFU/mL)로 바이러스 적규기를 계산합니다. 생체 내에서 BIRFLU 안정성을 평가하기 위해, 크리스탈 바이올렛 염색 플라크(감염성 바이러스 수, 4.4.12단계)의 수를 계산하여 리포터 발현 바이러스의 백분율을 계산하고 금성 및 Nluc 발현 플라크의 수와 비교합니다. 각각 4.4.7 단계와 4.4.11 단계)를 참조하십시오.