Interaktioner med och membran permeabilisering av hjärnans Mitokona av amyloid fibriller
Summary
Förutsatt här är ett protokoll för att undersöka samspelet mellan Native form, prefibrillar, och mogna amyloid fibriller av olika peptider och proteiner med mitokonskisolerade från olika vävnader och olika områden i hjärnan.
Abstract
En växande mängd bevis indikerar att membran permeabilisering, inklusive inre membran såsom mitokona, är ett vanligt inslag och primära mekanismen för amyloid aggregerad-inducerad toxicitet i neurodegenerativa sjukdomar. Emellertid, de flesta rapporter som beskriver mekanismerna för membran störningar är baserade på fosfolipid modellsystem, och studier som direkt riktar sig till händelser som inträffar på nivån av biologiska membran är sällsynta. Beskrivs här är en modell för att studera mekanismerna för amyloid toxicitet på membran nivå. För mitokondriell isolering används densitetsgradientmedium för att få preparat med minimal myelin-kontamination. Efter mitokondriell membran integritet bekräftelse, samspelet mellan amyloid fibriller som härrör från α-Synuclein, nötkreatur insulin, och hönsägg vit lysozym (HEWL) med råtta hjärnan Mitochondria, som en in vitro-biologisk modell, undersöks. Resultaten visar att behandling av hjärnans mitokona med fibrillar församlingar kan orsaka olika grader av membran depolarisering och ros innehålls förbättring. Detta indikerar struktur beroende interaktioner mellan amyloid fibriller och mitokondriellt membran. Det föreslås att de biofysiska egenskaperna hos amyloid fibriller och deras specifika bindning till mitokondriella membran kan ge förklaringar till några av dessa observationer.
Introduction
Amyloid-relaterade sjukdomar, kallas amyloidoser, utgör en stor grupp av sjukdomar som definieras av uppkomsten av olösliga protein fyndigheter i olika vävnader och organ1,2. Bland dem, neurodegenerativa sjukdomar är de vanligaste formerna där protein aggregat visas i centrala eller perifera nervsystemet2. Även om ett antal mekanismer har föreslagits för att vara inblandade i toxiciteten av amyloid aggregat3, en växande mängd bevis pekar på cellmembran störningar och permeabilisering som den primära mekanismen för amyloid patologi4, 5. Förutom plasmamembran, inre organeller (dvs, mitokona) kan också påverkas.
Intressant, framväxande bevis tyder på att mitokondriell dysfunktion spelar en avgörande roll i patogenesen av neurodegenerativa sjukdomar, inklusive Alzheimers och Parkinsons sjukdomar6,7. I enlighet med denna fråga har många rapporter indikerat bindning och ackumulering av amyloid β-peptid, α-Synuclein, huntingtin och ALS-länkade muterade SOD1 proteiner till mitokonen8,9,10, 11. mekanismen för membran permeabilisering av amyloid aggregat tros ske antingen genom bildandet av diskreta kanaler (porer) och/eller genom en icke-specifik tvättmedel-liknande mekanism5,12, 13. Det är anmärkningsvärt att de flesta av dessa slutsatser har baserats på rapporter som involverar fosfolipid modellsystem, och studier som direkt riktar sig till de händelser som förekommer i biologiska membran är sällsynta. Klart, dessa konstgjorda lipidbilayers återspeglar inte nödvändigtvis de inneboende egenskaperna hos biologiska membran, inklusive de av mitokonen, som är heterogena strukturer och består av en mängd olika fosfolipider och proteiner.
I den nuvarande studien används mitokondrien som isolerats från rått hjärnor som en in vitro-biologisk modell för att undersöka de destruktiva effekterna av amyloida fibriller som härrör från α-Synuclein (som ett amyloidogent protein), bovint insulin (som en modell peptid som visar betydande strukturell homologi med humant insulin som deltar i injektion-lokaliserad amyloidos), och hönsägg vit lysozym (HEWL; som en gemensam modell protein för studier av amyloid Aggregation). Interaktioner och eventuell skada på mitokondriella membran som induceras av amyloid fibriller utreds sedan genom att observera frisläppandet av mitokondriell malatdehydrogenas (MDH) (som finns i mitokondriell matris) och mitokondrier reaktivt syre Art (ROS) förbättring.
Protocol
Representative Results
Discussion
En mängd experimentella resultat stöder hypotesen att cytotoxiciteten av fibrillar aggregat är signifikant förknippad med deras förmåga att interagera med och permeabilize biologiska membran4,5. Emellertid, de flesta av uppgifterna är baserade på konstgjorda lipidbilayers som inte nödvändigtvis återspeglar de inneboende egenskaperna hos biologiska membran, som är heterogena strukturer med en mängd olika fosfolipider och proteiner. Här, med hjälp av…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av stipendier från forskningsrådet vid Institutet för avancerade studier i grundläggande vetenskaper (IASBS), Zanjan, Iran.
Materials
| 2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate | Sigma | 35845 | |
| Ammonium sulfate | Merck | 1012171000 | |
| Black 96-well plate | Corning | ||
| Black Clear-bottomed 96-well plate | Corning | ||
| Bovine insulin | Sigma | I6634 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A2153 | |
| BSA essentially fatty acid-free | Sigma | A6003 | |
| Centrifuge | Sigma | ||
| Crystal clear sealing tape | Corning | ||
| CuSO4 | Sigma | 451657 | |
| Dialysis bag (cut off 2 KDa) | Sigma | D2272 | |
| Dounce homogenizer | Potter Elvehjem | ||
| EDTA | Sigma | E9884 | |
| Fluorescence plate reader | BioTek | ||
| Fluorescence spectrophotometer | Cary Eclipse VARIAN | ||
| Folin | Merck | F9252 | |
| Glycine | Sigma | G7126 | |
| Guillotine | Made in Iran | ||
| HCl | Merck | H1758 | |
| Hen Egg White Lysozyme (HEWL) | Sigma | L6876 | |
| Na2CO3 | Sigma | S7795 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S7907 | |
| NaOH | Merck | S8045 | |
| Oxaloacetate | Sigma | O4126 | |
| Percoll | GE Healthcare | ||
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Sigma | CS0030 | |
| PMSF | Sigma | P7626 | |
| Potassium sodium tartrate | Sigma | 217255 | |
| Quartz cuvette | Sigma | ||
| Spectrophotometer | analytik jena | SPEKOL 2000 model | |
| Succinate | Sigma | S2378 | |
| Sucrose | Merck | 1076871000 | |
| Thermomixer | Eppendorph | ||
| Thioflavin T | Sigma | T3516 | |
| Tris-HCl | Merck | 1082191000 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
| Tryptone | QUELAB | ||
| Water bath | Memmert | ||
| Yeast Extract | QUELAB | ||
| β-NADH | Sigma | N8129 |
References
- Merlini, G., Bellotti, V. Molecular mechanisms of amyloidosis. New England Journal of Medicine. 349, 583-596 (2003).
- Berg, I. . Modeling amyloid disease in Drosophila melanogaster, Linköping Studies in Science and Technology Dissertation No. 1320. , (2010).
- Kagan, B. L., Uversky, V. N., Fink, A. L. Protein aggregation, ion channel formation, and membrane damage. Protein Misfolding, Aggregation, and Conformational Diseases. , 223-236 (2006).
- Demuro, A., et al. Calcium dysregulation and membrane disruption as a ubiquitous neurotoxic mechanism of soluble amyloid oligomers. The Journal of Biological Chemistry. 280, 17294-17300 (2005).
- Kayed, R., et al. Permeabilization of lipid bilayers is a common conformation-dependent activity of soluble amyloid oligomers in protein misfolding diseases. The Journal of Biological Chemistry. 279, 46363-46366 (2004).
- Manczak, M., Park, B. S., Jung, Y., Reddy, P. H. Differential expression of oxidative phosphorylation genes in patients with Alzheimer’s disease: implications for early mitochondrial dysfunction and oxidative damage. Neuromolecular Medicine. 5, 147-162 (2004).
- Vila, M., Ramonet, D., Perier, C. Mitochondrial alterations in Parkinson’s disease: new clues. Journal of Neurochemistry. 107, 317-328 (2008).
- Petersen, C. A. H., et al. The amyloid β-peptide is imported into mitochondria via the TOM import machinery and localized to mitochondrial cristae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 13145-13150 (2008).
- Devi, L., Raghavendran, V., Prabhu, B. M., Avadhani, N. G., Anandatheerthavarada, H. K. Mitochondrial import and accumulation of α-synuclein impair complex I in human dopaminergic neuronal cultures and Parkinson disease brain. The Journal of Biological Chemistry. 283, 9089-9100 (2008).
- Costa, V., Scorrano, L. Shaping the role of mitochondria in the pathogenesis of Huntington’s disease. EMBO Journal. 31, 1853-1864 (2012).
- Vande Velde, C., Miller, T. M., Cashman, N. R., Cleveland, D. W. Selective association of misfolded ALS-linked mutant SOD1 with the cytoplasmic face of mitochondria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 4022-4027 (2008).
- Kagan, B. L., Azimov, R., Azimova, R. Amyloid peptide channels. The Journal of Membrane Biology. 202, 1-10 (2004).
- Lashuel, H. A., Hartley, D., Petre, B. M., Walz, T., Lansbury, P. T. Neurodegenerative disease: amyloid pores from pathogenic mutations. Nature. 418, 291 (2002).
- Sims, N. R., Anderson, M. F. Isolation of mitochondria from rat brain using Percoll density gradient centrifugation. Nature Protocols. 3, 1228-1239 (2008).
- Ghobeh, M., et al. Interaction of Aβ (25-35) Fibrillation Products with Mitochondria: Effect of Small-Molecule Natural Products. Peptide Science. 102, 473-486 (2014).
- Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. Protein measurement with the folin phenol reagent. The Journal of Biological Chemistry. 193, 265-275 (1951).
- Sottocasa, G. L., Kuylenstierna, B., Ernester, L., Bergstrand, A. Separation and some enzymatic properties of the inner and outer membrane of rat liver mitochondria. Methods in Enzymology. 10, 448-463 (1967).
- Hoyer, W., et al. Dependence of a-Synuclein Aggregate Morphology on Solution Conditions. Journal of Molecular Biology. 322, 383-393 (2002).
- Weinreb, P. H., et al. NACP, a protein implicated in Alzheimer’s disease and learning, is natively unfolded. 生物化学. 35, 13709-13715 (1996).
- Porter, R. R. Partition chromatography of insulin and other proteins. The Biochemical Journal. 53, 320-328 (1953).
- Goldberg, M. E., Rudolph, R., Jaenicke, R. A kinetic study of the competition between renaturation and aggregation during the refolding of denatured reduced egg white lysozyme. 生物化学. 30, 2790-2797 (1991).
- Young, T. A., Cunningham, C. C., Bailey, S. M. Reactive oxygen species production by the mitochondrial respiratory chain in isolated rat hepatocytes and liver mitochondria: studies using myxothiazol. Archives of Biochemistry and Biophysics. 405, 65-72 (2002).
- Meratan, A. A., Ghasemi, A., Nemat-Gorgani, M. Membrane integrity and amyloid cytotoxicity: a model study involving mitochondria and lysozyme fibrillation products. Journal of Molecular Biology. 409, 826-838 (2011).
- Katebi, B., Mahdavimehr, M., Meratan, A. A., Ghasemi, A., Nemat-Gorgani, M. Protective effects of silibinin on insulin amyloid fibrillation, cytotoxicity and mitochondrial membrane damage. Archives of Biochemistry and Biophysics. 659, 22-32 (2018).
- Fink, A. L. The aggregation and fibrillation of alpha-synuclein. Accounts of Chemical Research. 39, 628-634 (2006).
- Diraviyam, K., Stahelin, R. V., Cho, W., Murray, D. Computer modeling of the membrane interaction of FYVE domains. Journal of Molecular Biology. 328, 721-736 (2003).
- Van Rooijen, B. D., Claessens, M., Subramaniam, V. Lipid bilayer disruption by oligomeric α-synuclein depends on bilayer charge and accessibility of the hydrophobic core. Biochimica et Biophysica Acta. 1788, 1271-1278 (2009).
- Kourie, J. I., Henry, C. L. Ion channel formation and membrane-linked pathologies of misfolded hydrophobic proteins: the role of dangerous unchaperoned molecules. Clinical and Experimental Pharmacology & Physiology. 29, 741-753 (2002).
- Bucciantini, M., et al. Inherent toxicity of aggregates implies a common mechanism for protein misfolding diseases. Nature. 416, 507-511 (2002).
- Bolognesi, B., et al. ANS binding reveals common features of cytotoxic amyloid species. ACS Chemical Biology. 5, 735-740 (2010).
- Posse, E., De Arcuri, B. F., Morero, R. D. Lysozyme interactions with phospholipid vesicles: relationships with fusion and release of aqueous content. Biochimica et Biophysica Acta. 1193, 101-106 (1994).
- Roqanian, S., et al. Polyphenols protect mitochondrial membrane against permeabilization induced by HEWL oligomers: possible mechanism of action. International Journal of Biological Macromolecules. 103, 709-720 (2017).
- Ulmer, T. S., Bax, A., Cole, N. B., Nussbaum, R. L. Structure and dynamics of micelle-bound human alphasynuclein. The Journal of Biological Chemistry. 280, 9595-9603 (2005).
- Stockl, M., Fischer, P., Wanker, E., Herrmann, A. Alpha-synuclein selectively binds to anionic phospholipids embedded in liquid-disordered domains. Journal of Molecular Biology. 375, 1394-1404 (2008).
- Devi, L., et al. Mitochondrial import and accumulation of α-synuclein impair complex I in human dopaminergic neuronal cultures and Parkinson disease brain. The Journal of Biological Chemistry. 283, 9089-9100 (2008).
- Ghio, S., Kamp, F., Cauchi, R., Giese, A., Vassallo, N. Interaction of α-synuclein with biomembranes in Parkinson’s disease-role of cardiolipin. Progress in Lipid Research. 61, 73-82 (2016).
- Petersen, C. A. H., et al. The amyloid β-peptide is imported into mitochondria via the TOM import machinery and localized to mitochondrial cristae. Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 13145-13150 (2008).
- Costa, V., Scorrano, L. Shaping the role of mitochondria in the pathogenesis of Huntington’s disease. EMBO Journal. 31, 1853-1864 (2012).
- Vande Velde, C., Miller, T. M., Cashman, N. R., Cleveland, D. W. Selective association of misfolded ALS-linked mutant SOD1 with the cytoplasmic face of mitochondria. Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 4022-4027 (2008).
- Oladzad Abbasabadi, A., et al. Disruption of mitochondrial membrane integrity induced by amyloid aggregates arising from variants of SOD1. International Journal of Biological Macromolecules. 61, 212-217 (2013).
