Förutsatt här är ett protokoll för att undersöka samspelet mellan Native form, prefibrillar, och mogna amyloid fibriller av olika peptider och proteiner med mitokonskisolerade från olika vävnader och olika områden i hjärnan.
En växande mängd bevis indikerar att membran permeabilisering, inklusive inre membran såsom mitokona, är ett vanligt inslag och primära mekanismen för amyloid aggregerad-inducerad toxicitet i neurodegenerativa sjukdomar. Emellertid, de flesta rapporter som beskriver mekanismerna för membran störningar är baserade på fosfolipid modellsystem, och studier som direkt riktar sig till händelser som inträffar på nivån av biologiska membran är sällsynta. Beskrivs här är en modell för att studera mekanismerna för amyloid toxicitet på membran nivå. För mitokondriell isolering används densitetsgradientmedium för att få preparat med minimal myelin-kontamination. Efter mitokondriell membran integritet bekräftelse, samspelet mellan amyloid fibriller som härrör från α-Synuclein, nötkreatur insulin, och hönsägg vit lysozym (HEWL) med råtta hjärnan Mitochondria, som en in vitro-biologisk modell, undersöks. Resultaten visar att behandling av hjärnans mitokona med fibrillar församlingar kan orsaka olika grader av membran depolarisering och ros innehålls förbättring. Detta indikerar struktur beroende interaktioner mellan amyloid fibriller och mitokondriellt membran. Det föreslås att de biofysiska egenskaperna hos amyloid fibriller och deras specifika bindning till mitokondriella membran kan ge förklaringar till några av dessa observationer.
Amyloid-relaterade sjukdomar, kallas amyloidoser, utgör en stor grupp av sjukdomar som definieras av uppkomsten av olösliga protein fyndigheter i olika vävnader och organ1,2. Bland dem, neurodegenerativa sjukdomar är de vanligaste formerna där protein aggregat visas i centrala eller perifera nervsystemet2. Även om ett antal mekanismer har föreslagits för att vara inblandade i toxiciteten av amyloid aggregat3, en växande mängd bevis pekar på cellmembran störningar och permeabilisering som den primära mekanismen för amyloid patologi4, 5. Förutom plasmamembran, inre organeller (dvs, mitokona) kan också påverkas.
Intressant, framväxande bevis tyder på att mitokondriell dysfunktion spelar en avgörande roll i patogenesen av neurodegenerativa sjukdomar, inklusive Alzheimers och Parkinsons sjukdomar6,7. I enlighet med denna fråga har många rapporter indikerat bindning och ackumulering av amyloid β-peptid, α-Synuclein, huntingtin och ALS-länkade muterade SOD1 proteiner till mitokonen8,9,10, 11. mekanismen för membran permeabilisering av amyloid aggregat tros ske antingen genom bildandet av diskreta kanaler (porer) och/eller genom en icke-specifik tvättmedel-liknande mekanism5,12, 13. Det är anmärkningsvärt att de flesta av dessa slutsatser har baserats på rapporter som involverar fosfolipid modellsystem, och studier som direkt riktar sig till de händelser som förekommer i biologiska membran är sällsynta. Klart, dessa konstgjorda lipidbilayers återspeglar inte nödvändigtvis de inneboende egenskaperna hos biologiska membran, inklusive de av mitokonen, som är heterogena strukturer och består av en mängd olika fosfolipider och proteiner.
I den nuvarande studien används mitokondrien som isolerats från rått hjärnor som en in vitro-biologisk modell för att undersöka de destruktiva effekterna av amyloida fibriller som härrör från α-Synuclein (som ett amyloidogent protein), bovint insulin (som en modell peptid som visar betydande strukturell homologi med humant insulin som deltar i injektion-lokaliserad amyloidos), och hönsägg vit lysozym (HEWL; som en gemensam modell protein för studier av amyloid Aggregation). Interaktioner och eventuell skada på mitokondriella membran som induceras av amyloid fibriller utreds sedan genom att observera frisläppandet av mitokondriell malatdehydrogenas (MDH) (som finns i mitokondriell matris) och mitokondrier reaktivt syre Art (ROS) förbättring.
En mängd experimentella resultat stöder hypotesen att cytotoxiciteten av fibrillar aggregat är signifikant förknippad med deras förmåga att interagera med och permeabilize biologiska membran4,5. Emellertid, de flesta av uppgifterna är baserade på konstgjorda lipidbilayers som inte nödvändigtvis återspeglar de inneboende egenskaperna hos biologiska membran, som är heterogena strukturer med en mängd olika fosfolipider och proteiner. Här, med hjälp av…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av stipendier från forskningsrådet vid Institutet för avancerade studier i grundläggande vetenskaper (IASBS), Zanjan, Iran.
2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate | Sigma | 35845 | |
Ammonium sulfate | Merck | 1012171000 | |
Black 96-well plate | Corning | ||
Black Clear-bottomed 96-well plate | Corning | ||
Bovine insulin | Sigma | I6634 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A2153 | |
BSA essentially fatty acid-free | Sigma | A6003 | |
Centrifuge | Sigma | ||
Crystal clear sealing tape | Corning | ||
CuSO4 | Sigma | 451657 | |
Dialysis bag (cut off 2 KDa) | Sigma | D2272 | |
Dounce homogenizer | Potter Elvehjem | ||
EDTA | Sigma | E9884 | |
Fluorescence plate reader | BioTek | ||
Fluorescence spectrophotometer | Cary Eclipse VARIAN | ||
Folin | Merck | F9252 | |
Glycine | Sigma | G7126 | |
Guillotine | Made in Iran | ||
HCl | Merck | H1758 | |
Hen Egg White Lysozyme (HEWL) | Sigma | L6876 | |
Na2CO3 | Sigma | S7795 | |
NaH2PO4 | Sigma | S7907 | |
NaOH | Merck | S8045 | |
Oxaloacetate | Sigma | O4126 | |
Percoll | GE Healthcare | ||
Phosphate Buffer Saline (PBS) | Sigma | CS0030 | |
PMSF | Sigma | P7626 | |
Potassium sodium tartrate | Sigma | 217255 | |
Quartz cuvette | Sigma | ||
Spectrophotometer | analytik jena | SPEKOL 2000 model | |
Succinate | Sigma | S2378 | |
Sucrose | Merck | 1076871000 | |
Thermomixer | Eppendorph | ||
Thioflavin T | Sigma | T3516 | |
Tris-HCl | Merck | 1082191000 | |
Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
Tryptone | QUELAB | ||
Water bath | Memmert | ||
Yeast Extract | QUELAB | ||
β-NADH | Sigma | N8129 |