Synthese van een Deuterated norm voor de kwantificering van 2-arachidonoylglycerol in Caenorhabditis elegans
Summary
Dit werk beschrijft een robuuste en ongecompliceerde methode om de endocannabinoïde 2-arachidonoylglycerol (2-AG) in C. elegansop te sporen en te kwantificeren. Een analytische HDO standaard ons voorbereid en gebruikt voor de kwantificering van 2-AG door isotopen verdunning en vloeistofchromatografie-elektro spray ionisatie-tandem massaspectrometrie (LC-ESI-MS/MS).
Abstract
Dit werk presenteert een methode om een analytische standaard te bereiden voor het analyseren van 2-Arachidonoyl glycerol (2-AG) kwalitatief en kwantitatief door vloeistofchromatografie-elektro spray ionisatie-tandem massaspectrometrie (LC-ESI-MS/MS). Endocannabinoïden zijn gecondengeerde lipide-bemiddel kers die meerdere biologische processen in verschillende organismen reguleren. In C. elegans, 2-AG is gebleken dat het bezitten van verschillende rollen, met inbegrip van de modulatie van Dauer vorming en cholesterol metabolisme. Dit verslag beschrijft een methode om de moeilijkheden te overwinnen die gepaard gaan met de kosten en stabiliteit van HDO normen die voor 2-AG kwantificering vereist zijn. De procedure voor de synthese van de standaard is eenvoudig en kan worden uitgevoerd in elk laboratorium, zonder de noodzaak voor organische synthese expertise of speciale apparatuur. Daarnaast wordt een wijziging van de methode van Folch om de HDO standaard uit de C. elegans -cultuur te extraheren beschreven. Tot slot wordt een kwantitatieve en analytische methode beschreven voor het detecteren van 2-AG met behulp van de stabiele isotopisch gelabelde analoge 1-AG-d5 , die betrouwbare resultaten oplevert in een snelle chromatografische uitvoering. De procedure is nuttig voor het bestuderen van de meerdere rollen van 2-AG in C. elegans terwijl ook van toepassing op andere studies van metabolieten in verschillende organismen.
Introduction
Endocannabinoïden reguleren meerdere biologische processen in een verscheidenheid van organismen en worden bewaard lipide-mediatoren1. De eerste ontdekte en meest goed gekarakteriseerde endocannabinoïden zijn anandamide (arachidonoylethanolamide, AEA) en 2-Arachidonoyl glycerol (2-AG). Endocannabinoïden spelen vele kritische rollen, met inbegrip van degenen die betrokken zijn bij hersenen beloning systemen, evenals drugsverslaving, geheugen, stemming, en metabole processen2. AEA en 2-AG zijn alleen gesynthetiseerd wanneer nodig en hebben een korte levensduur, en ze worden afgebroken door transport eiwit heropname en hydrolyse3.
Het gebruik van diermodellen zoals Caenorhabditis elegans (C. elegans) is belangrijk geworden om te bestuderen van de grote verscheidenheid van biologische processen, met inbegrip van apoptosis, cel signalering, celcyclus, celpolariteit, genregulatie, metabolisme, veroudering, en Geslachtsbepaling4,5. Daarnaast is C. elegans een uitstekend model voor het bestuderen van de fysiologische rollen van meervoudig onverzadigde vetzuren (pufas). AEA is geïdentificeerd in C. elegans en wordt verlaagd onder dieet beperking6. Dit tekort verlengt de levensduur van de nematode door middel van een dieet restrictie mechanisme dat kan worden onderdrukt door suppletie met de endocannabinoïde. Onlangs werd ontdekt dat 2-AG en AEA spelen fundamentele rollen in de regulering van de cholesterol handel in C. elegans7. Nog belangrijker, er werd vastgesteld dat suppletie met exogene 2-AG Dauer arrestatie kan redden, die wordt veroorzaakt door de verminderde cholesterol handel in Niemann-Pick type C1 C. elegans mutanten.
Om een beter begrip van 2-AG de relatie met cholesterol handel en andere biologische processen in de nematode (dat wil zeggen, monoaminerge signalering, nociception en motoriek) te krijgen, is het cruciaal om deze endogene metaboliet te bestuderen en hoe het is beïnvloed onder bepaalde milieu-en dieet omstandigheden8,9,10,11,12,13. Daarom is het noodzakelijk om te ontwerpen en optimaliseren van een methode voor het opsporen en kwantificeren van endogene 2-AG in C. elegans dat is eenvoudig te gebruiken voor wetenschappers van verschillende gebieden, vooral degenen die het gedrag van de nematode in verband met deze bestuderen endocannabinoïde.
In 2008 slaagden Lethonen en collega’s erin om 2-AG en AEA in C. elegans te identificeren met behulp van LC-MS analytische methoden14. In 2011 slaagden ze erin om deze techniek uit te breiden naar andere endocannabinoïden15. Meer recent werk toont andere analytische methoden die succesvol zijn geweest bij het opsporen en kwantificeren van endocannabinoïden in C. elegans, waaronder massaspectrometrie en GC-MS16,17,18, en het heeft ook is gemeld dat soortgelijke analytische methoden kunnen worden uitgebreid naar andere modellen19.
Eerder gemelde analysemethoden voor het kwantificeren van 2-AG in biologische monsters betreffen meestal het gebruik van HDO normen die commercieel worden verworven en die beschikbaar moeten zijn voor de aankoop20,21. Veel analytische normen voor LC-MS/MS kwantificering van endocannabinoïden zijn commercieel verkrijgbaar bij verschillende aanbieders. Niettemin, ze zijn duur, zijn gevoelig, en worden geoxideerd na verloop van tijd, als gevolg van de aanwezigheid van meerdere dubbele obligaties. De meest voorkomende versies van deze normen zijn gebaseerd op het OCTA-deuterated arachidonzuur en zijn geschikt voor kwantificering door isotoop verdunning LC-MS/MS14,22. Ook, de meeste van deze normen worden vervangen in positie 2 van de glycerol, waardoor ze instabiel onder de meeste omstandigheden, omdat ze gevoelig voor acyl migratie zijn19,23.
Om de moeilijkheden in verband met de kosten en stabiliteit van deze HDO normen te overwinnen, wordt een handige en eenvoudige methode voorgesteld om een analytische norm op basis van glycerol-d5voor te bereiden. De volgorde om de penta-deuterated standaard voor te bereiden vereist een drie stappen procedure die resulteert in de standaard 1-AG-d5, die stabiel is en geen acyl migratie ondergaat (het belangrijkste probleem bij het streven naar het synthetiseren van 2-monoacylglycerolen).
Het belangrijkste doel hier is om een eenvoudige en reproduceerbare methode te tonen voor het bestuderen van 2-AG in C. elegans, inclusief de synthese van de analytische HDO norm, bereiding en extractie van de nematode monsters, en analyse door LC-MS/MS (Figuur 1 ). Deze synthetische procedure is haalbaar zonder de geraffineerde organische synthese kennis of speciale apparatuur, waardoor het geschikt is voor wetenschappers van verschillende vakgebieden die C. elegans gedrag onder endocannabinoïde invloed bestuderen. De methode is ook uitbreidbaar naar andere studiemodellen, waardoor het nuttig is voor verschillende doelen. De standaard, bereid zoals hier gerapporteerd, is toegepast om met succes een snelle en betrouwbare chromatografische methode te ontwikkelen die een effectieve detectie en kwantificering van 2-AG op een reproduceerbare manier mogelijk maakt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Endocannabinoïden zijn een klasse van lipiden die betrokken zijn bij de regulatie van de Dauer formatie in C. elegans7. Specifieker, de synthese van meervoudig onverzadigde vetzuren (PUFAs) is belangrijk voor de handel in cholesterol en de reproductieve ontwikkeling van wormen. Het wordt hier onthuld dat 2-AG, een arachidonzuur dat endocannabinoïde bevat, verantwoordelijk is voor het restituting van de Dauer larve tot zijn normale cyclus in wormen die een verminderd cholesterol metaboli…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door een onderzoeksbeurs van de Agencia Nacional de Promoción científica y Tecnológica (ANPCyT, PICT 2014-3693). J.F.d.L., G.P. en B.H.C. zijn Fellows van CONICET. D.d.M. en G.R.L. zijn lid van de Onderzoeksafloop van CONICET. We zijn dankbaar Gonzalo Lamberto (INMET) voor LC-MS/MS analyse en nuttige discussie. Video-opnamen en bewerking is gedaan door Ramiro Ortega en María Soledad Casasola van Dirección de comunicación de la Ciencia, Facultad de Ciencia Política y Relaciones Internacionales, Universidad Nacional de Rosario in Rosario, Argentinië.
Materials
| 4-dimethylaminopyridine | Sigma-Aldrich | 107700 | reagent grade, 99% |
| antioxidant BHT | Sigma-Aldrich | W21805 | |
| Arachidonic acid | Sigma-Aldrich | 10931 | |
| Glycerol-d8 | Sigma-Aldrich | 447498 | |
| Mass detector Triple Quadrupole | Thermo Scientific | TSQ Quantum Access Max | |
| N,N’-diisopropylcarbodiimide | Sigma-Aldrich | D125407 | |
| NMR spectrometer | Bruker | Avance II 300 MHz | |
| reversed-phase HPLC column | Thermo Fisher | 25003-052130 | C18 Hypersil-GOLD (50 x 2.1 mm) |
| tert-Butyldimethylsilyl chloride | Sigma-Aldrich | 190500 | reagent grade, 97% |
| tetrabutylammonium fluoride | Sigma-Aldrich | 216143 | 1.0M in THF |
| UHPLC System | Thermo Scientific | Ultimate 3000 RSLC Dionex | |
| worm strain N2 Bristol | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) |
References
- McPartland, J. M., Matias, I., Di Marzo, V., Glass, M. Evolutionary origins of the endocannabinoid system. Gene. 370, 64-74 (2006).
- Le Foll, B., Goldberg, S. R. Cannabinoid CB1 receptor antagonists as promising new medications for drug dependence. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 312 (3), 875-883 (2005).
- Pesce, M., Esposito, G., Sarnelli, G. Endocannabinoids in the treatment of gastrointestinal inflammation and symptoms. Current Opinion in Pharmacology. 43, 81-86 (2018).
- Hulme, S. E., Whitesides, G. M. Chemistry and the worm: Caenorhabditis elegans as a platform for integrating chemical and biological research. Angewandte Chemie International Edition. 50 (21), 4774-4807 (2011).
- Aitlhadj, L., Stürzenbaum, S. R. Caenorhabditis elegans in regenerative medicine: a simple model for a complex discipline. Drug Discovery Today. 19 (6), 730-734 (2014).
- Lucanic, M., et al. N-acylethanolamine signalling mediates the effect of diet on lifespan in Caenorhabditis elegans. Nature. 473 (7346), 226-229 (2011).
- Galles, C., et al. Endocannabinoids in Caenorhabditis elegans are essential for the mobilization of cholesterol from internal reserves. Scientific Reports. 8 (1), 6398 (2018).
- Kurihara, J., et al. 2-Arachidonoylglycerol and Anandamide Oppositely Modulate Norepinephrine Release from the Rat Heart Sympathetic Nerves. The Japanese Journal of Pharmacology. 87 (1), 93-96 (2001).
- Harris, G., et al. Dissecting the Serotonergic Food Signal Stimulating Sensory-Mediated Aversive Behavior in C. elegans. PLoS ONE. 6 (7), e21897 (2011).
- Pastuhov, S. I., Matsumoto, K., Hisamoto, N. Endocannabinoid signaling regulates regenerative axon navigation in Caenorhabditis elegans via the GPCRs NPR-19 and NPR-32. Genes to Cells. 21 (7), 696-705 (2016).
- Oakes, M. D., Law, W. J., Clark, T. Cannabinoids Activate Monoaminergic Signaling to Modulate Key C. elegans Behaviors. Journal of Neuroscience. 37 (11), 2859-2869 (2017).
- Sofia, R. D., Nalepa, S. D., Harakal, J. J., Vassar, H. B. Anti-edema and analgesic properties of Δ9-tetrahydrocannabinol (THC). Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 186 (3), 646-655 (1973).
- Mills, H., et al. Monoamines and neuropeptides interact to inhibit aversive behaviour in Caenorhabditis elegans. The EMBO Journal. 31 (3), 667-678 (2012).
- Lehtonen, M., Reisner, K., Auriola, S., Wong, G., Callaway, J. C. Mass-spectrometric identification of anandamide and 2-arachidonoylglycerol in nematodes. Chemistry & Biodiversity. 5 (11), 2431-2441 (2008).
- Lehtonen, M., et al. Determination of endocannabinoids in nematodes and human brain tissue by liquid chromatography electrospray ionization tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 879 (11-12), 677-694 (2011).
- Aarnio, V., et al. Caenorhabditis Elegans Mutants Predict Regulation of Fatty Acids and Endocannabinoids by the CYP-35A Gene Family. Frontiers in Pharmacology. 2 (12), 12 (2011).
- Annibal, A., Karalay, &. #. 2. 1. 4. ;., Latza, C., Antebi, A. A novel EI-GC/MS method for the accurate quantification of anti-aging compound oleoylethanolamine in C. elegans. Analytical Methods. 10 (22), 2551-2559 (2018).
- Oakes, M., Law, W. J., Komuniecki, R. Cannabinoids Stimulate the TRP Channel-Dependent Release of Both Serotonin and Dopamine to Modulate Behavior in C. elegans. The Journal of Neuroscience. 39 (21), 4142-4152 (2019).
- Batugedara, H. M., et al. Helminth-Derived Endocannabinoids That Have Effects on Host Immunity Are Generated during Infection. Infection and Immunity. 86 (11), e00441 (2018).
- Zhang, M. Y., et al. Simultaneous determination of 2-arachidonoylglycerol, 1-arachidonoylglycerol and arachidonic acid in mouse brain tissue using liquid chromatography/tandem mass spectrometry. Journal of Mass Spectrometry. 45 (2), 167-177 (2010).
- Zoerner, A. A., et al. Simultaneous UPLC-MS/MS quantification of the endocannabinoids 2-arachidonoyl glycerol (2AG), 1-arachidonoyl glycerol (1AG), and anandamide in human plasma: Minimization of matrix-effects, 2AG/1AG isomerization and degradation by toluene solvent extraction. Journal of Chromatography B. 883-884, 161-171 (2012).
- Ivanov, I., Borchert, P., Hinz, B. A simple method for simultaneous determination of N-arachidonoylethanolamine, N-oleoylethanolamine, N-palmitoylethanolamine and 2-arachidonoylglycerol in human cells. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407 (6), 1781-1787 (2015).
- Keereetaweep, J., Chapman, K. D. Lipidomic Analysis of Endocannabinoid Signaling: Targeted Metabolite Identification and Quantification. Neural Plasticity. , (2016).
- Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).
- Zoerner, A. A., et al. Quantification of endocannabinoids in biological systems by chromatography and mass spectrometry: a comprehensive review from an analytical and biological perspective. Biochimica et Biophysica Acta. 1811 (11), 706-723 (2011).
