단세포 RNA 시퀀싱 및 인간 췌장 섬 분석
Summary
여기서, 우리는 액적 기반 의 미세 유체 단일 세포 RNA 염기서열 분석 기술을 사용하여 단면 췌도로부터 단일 세포의 고품질, 대규모 전사체 데이터를 생성하는 프로토콜을 제시한다.
Abstract
췌도는 독특한 호르몬 발현 패턴을 가진 내분비 세포로 구성됩니다. 내분비 세포는 정상 및 병리학 적 조건에 대한 응답에서 기능적 차이를 보여줍니다. 이 프로토콜의 목표는 액적 기반 미세 유체 단일 세포 RNA 염기서열 분석 기술을 사용하여 각 내분비 세포 유형의 고품질, 대규모 전사체 데이터를 생성하는 것입니다. 이러한 데이터는 정상 또는 특정 조건에서 각 내분비 세포 유형의 유전자 발현 프로필을 구축하는 데 활용될 수 있다. 이 공정에는 신중한 취급, 정확한 측정 및 엄격한 품질 관리가 필요합니다. 이 프로토콜에서는 인간 췌도 해리, 시퀀싱 및 데이터 분석을 위한 자세한 단계를 설명합니다. 약 20,000개의 인간 단일 아일렛 세포의 대표적인 결과는 프로토콜의 성공적인 적용을 입증한다.
Introduction
췌 장 섬 혈액 포도 당 수준을 조절 하는 내 분 비 호르몬을 해제. 기능적으로 그리고 형태학적으로 다른 5개의 내분비 세포 모형은, 이 필수적인 역할에 관여합니다: α 세포는 글루카곤, β 세포 인슐린, δ 세포 소마토스타틴, PP세포 췌장 폴리펩티드 및 θ 세포 그렐린 1을 생성합니다. 유전자 발현 프로파일링은 정상 또는 특정 조건에서 내분비 세포를 특성화하는 유용한 접근법이다. 역사적으로, 전체 아일렛 유전자 발현 프로파일링은 마이크로어레이 및 차세대RNA 시퀀싱 2, 3,4,5,6,7을 사용하여 생성되었다. , 8.전체 아일렛 전사체는 장기 특이적 전사체 및 질병 후보 유전자를 식별하는 데 유익하지만, 각 아일렛 세포 유형의 분자 이질성을 밝히지 못한다. 레이저 포획 미세 해부 (LCM) 기술은 섬9,10,11,12에서 특정 세포 유형을 직접 얻기 위해 적용되었지만 표적 세포의 순도에 미치지 못합니다. 인구. 이러한 한계를 극복하기 위해, 형광 활성화 세포 선별(FACS)은 α-및 β세포(13,14,15,16)와 같은 특정 내분비 세포 집단을 선택하는 데 사용되어 왔다. , 17세 , 18. 또한, Dorrell 외. 4 개의 하위 집단으로 β 세포를 분류하는 항체 기반 FACS 분류 접근 방식을 사용19. FACS-정렬 된 섬 세포는 또한 단일 세포의 RNA 시퀀싱을 위해 도금 될 수 있습니다. 그러나 플레이트 기반 방법은 확장성20,21,22에서어려움을 겪습니다.
각 내분비 세포 유형의 고품질, 대규모 전사체 데이터를 생성하기 위해 인간 아일렛 세포에 미세 유체 기술을 적용했습니다. 미세 유체 플랫폼은 높은 처리량, 고품질 및 확장 가능한 방식으로 많은 수의 단일 셀로부터 전사체 데이터를 생성합니다23,24,25,26,27. 다량으로 포획된 세포 유형의 분자 특성을 밝히는 것 외에도, 확장성이 뛰어난 미세 유체 플랫폼은 충분한 세포가 제공될 때 희귀 세포 유형을 식별할 수 있게 합니다. 따라서, 인간 췌도에 플랫폼을 적용하면 그렐린 분비 σ-세포의 프로파일링을 허용하인데, 그 희소성(28)으로 인해거의 알려지지 않은 기능을 가진 희귀한 내분비 세포 유형이다. 최근 몇 년 동안, 여러 연구는 기술29,30,31,32를사용하여 인간 작은 섬의 대규모 전사 데이터를보고 우리와 다른 사람에 의해 출판되었다, 33. 데이터는 내분비 세포 이질성과 질병에 미치는 영향을 연구하기 위해 아일렛 커뮤니티를 위해 공개적으로 사용할 수 있고 유용한 자원입니다.
여기에서, 우리는 α-, β-, δ-, PP, 및 비내분비 세포의 더 작은 비율을 포함하여 대략 20,000개의 인간 적인 작은 islet 세포의 전사체 데이터를 생성하기 위하여 이용된 액적계 미유체 단세포 RNA 염기서열 분석 프로토콜을 기술합니다 32. 워크플로는 고립 된 인간 섬으로 시작하여 섬 세포 해리, 단일 셀 캡처 및 데이터 분석의 단계를 묘사합니다. 이 프로토콜은 갓 분리된 섬을 사용해야 하며 설치류와 같은 인간 및 기타 종의 섬에 적용할 수 있습니다. 이 워크플로우를 사용하여 기준선 및 기타 조건에서 편견없고 포괄적인 아일렛 셀 아틀라스를 구축할 수 있습니다.
Protocol
1. 인간 섬 해리 특정 인구 통계학을 가진 기증자의 작은 섬이 연구 목적을 위해 요구되지 않는 한, 15-80 년 사이, 어느 성의 시체 기관 기증자로부터 고립 된 인간의 섬을 얻을, 기존의 질병없이. 격리 후, 분리된 섬을 공급업체에서 2-3일 동안 조직 배양 시설에 보관한다. 종종 아일렛 손상이 보이려면 1 일 이상 걸립니다. 작은 섬을 병에 담고 섬 매체에 완전히 담그십시오. 하?…
Representative Results
단세포 RNA 염기서열 분석 워크플로우는 3단계로 구성됩니다: 손상되지 않은 인간 섬을 단일 세포 현탁액으로 해리하고, 액적 기반 기술을사용하여 단일 세포를 포착하고, RNA-seq 데이터를 분석합니다(그림 1). 첫째, 획득 된 인간 섬은 하룻밤 동안 배양되었다. 온전한 섬을 현미경으로 검사하였다(도2A). 해리된 아일렛 세포의 무?…
Discussion
최근 개발된 단세포 기술은 인간 췌도에서 세포 유형을 특성화하고 분자 이질성을 연구하는 새로운 플랫폼을 제공합니다. 우리는 인간 섬을 연구하기 위해 액적 기반 미세 유체 단일 세포 격리 및 데이터 분석 프로토콜을 채택했습니다. 우리의 프로토콜은 서열 품질 및 배치 효과에 상대적으로 작은 변화를 가진 20,000 개 이상의 단일 인간 아일렛 세포에서 RNA 시퀀싱 데이터를 성공적으로 생산했?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
없음
Materials
| 30 µm Pre-Separation Filters | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | Cell strainer |
| 8-chamber slides | Chemometec | 102673-680 | Dell counting assay slides |
| Bioanalyzer High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 5067-4626 | for QC |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9647 | Single cell media |
| Chromium Single Cell 3' Library & Gel Bead Kit v2, 16 rxns | 10X Genomics | 120237 | Single cell reagents |
| Chromium Single Cell A Chip Kit v2, 48 rx (6 chips) | 10X Genomics | 120236 | Microfluidic chips |
| CMRL-1066 | ThermoFisher | 11530-037 | Complete islet media |
| EB Buffer | Qiagen | 19086 | Elution buffer |
| Eppendorf twin-tec PCR plate, 96-well, blue, semi-skirted | VWR | 47744-112 | Emulsion plate |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher | 16000-036 | Complete islet media |
| Human islets | Prodo Labs | HIR | Isolated human islets |
| L-Glutamine (200 mM) | ThermoFisher | 25030-081 | Complete islet media |
| Nextera DNA Library Preparation Kit (96 samples) | Illumina | FC-121-1031 | Library preparation reagents |
| NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5 (75 cycles) | Illumina | FC-404-2005 | Sequencing |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher | 15140-122 | Complete islet media |
| Qubit High Sensitivity dsDNA Kit | Life Technologies | Q32854 | for QC |
| Solution 18 | Chemometec | 103011-420 | Cell counting assay reagent |
| SPRISelect Reagent | Fisher Scientific | B23318 | Purification beads |
| Tissue Culture Dishes (10 cm) | VWR | 10861-594 | for islet culture |
| TrypLE Express | Life Technologies | 12604-013 | Cell dissociation solution |
| Zymo DNA Clean & Concentrator-5, 50 reactions | VWR | 77001-152 | Library clean up columns |
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Cite This Article
Xin, Y., Adler, C., Kim, J., Ding, Y., Ni, M., Wei, Y., Macdonald, L., Okamoto, H. Single-cell RNA Sequencing and Analysis of Human Pancreatic Islets. J. Vis. Exp. (149), e59866, doi:10.3791/59866 (2019).