JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
生物化学

Inositol fosfat veya Phosphoinositide etkileşim proteinleri yakınlık Kromatografi Batı Blot veya kütle spektrometresi ile bağlantılı olarak tanımlanması

Published: July 26, 2019
doi:
10.3791/59865
1Institute of Parasitology,McGill University

Summary

Bu protokol, inositol fosfatlar veya fosfoinositidler bağlayan proteinlerin tanımlanması üzerinde duruluyor. Bu etanol veya manyetik boncuklar için streptavidin üzerinden immobilize olan biyotinlenmiş inositol fosfatlar veya fosfoinositidler ile benzeşme Kromatografi kullanır. Inositol fosfat veya fosfoinositide bağlayıcı proteinler Batı lekesi veya kütle spektrometresi ile tanımlanır.

Abstract

İnositol Fosfatlar ve fosfoinositidler, gen ifadesi, vezikül kaçakçılığı, sinyal iletimi, metabolizma ve gelişim dahil olmak üzere Ökaryotlar içinde çeşitli hücresel süreçleri düzenler. Bu metabolitler proteinlere bağlayarak, böylece protein konformasyonu, katalitik aktivite ve/veya etkileşimleri değiştirerek bu düzenleyici aktivite gerçekleştirin. Burada açıklanan yöntem, Inositol fosfatlar veya fosfoinositidler ile etkileşimde bulunan proteinleri belirlemek için kütle spektrometresi veya Batı blomlamaya bağlı benzeşme Kromatografi kullanır. İnositol fosfatlar veya fosfoinositidler kimyasal olarak biotin ile etiketlenmiştir, bu da agaroz veya manyetik boncuklar için conjuated streptavidin aracılığıyla yakalanan. Proteinlerin metabolite bağlanması onların yakınlık tarafından izole edilir, sonra elüe ve kütle spektrometresi ya da Batı lekeleme tarafından tanımlanır. Yöntem hassasiyet ile protein ve metabolit etkileşimi analizini destekleyen, hassas, radyoaktif olmayan, Liposome-ücretsiz ve özelleştirilebilir basit bir iş akışı vardır. Bu yaklaşım, kompleks biyolojik örneklerde veya arıtılmış proteinleri kullanarak protein-metabolit etkileşimlerini belirlemek için etiketsiz veya amino asit etiketli nicel kütle spektrometresi yöntemlerinde kullanılabilir. Bu protokol tripanosoma bruceiproteinleri analizi için optimize edilmiştir, ancak ilgili protozoon parazitleri, Maya veya memeliyen hücrelere adapte edilebilir.

Introduction

İnositol fosfat (IPS) ve phosphoinositides (PIS) gen ifadesi1,2,3, vezikül kaçakçılığı kontrolü gibi hücresel süreçlerin düzenlenmesi yoluyla ökaryote biyolojisinde merkezi bir rol oynamaktadır 4, sinyal dönüştürücü5,6, metabolizma7,8,9, ve geliştirme8,10. Bu metabolitlerin düzenleyici fonksiyonu proteinlerle etkileşim ve böylece protein fonksiyonunu düzenleyen yeteneğinden sonuçlanır. Proteinler tarafından bağlayıcı üzerine, IPS ve protein konformasyonu11değiştirebilir, katalitik aktivite12, veya etkileşimler13 ve dolayısıyla hücresel fonksiyonunu etkiler. IPS ve, Nucleus2,3,14,15, endoplazmik retikulum16,17, Plasma gibi birden fazla alt hücreli bölmeler halinde dağıtılır membran1 ve sitsol18, proteinlerle ilişkili3,19 veya Rnas20.

Membran ile ilişkili PI (4, 5) P2 fosfolipase C tarafından pedi (1, 4, 5) P3, hangi fosforilize edilebilir veya IP kinazları ve fosfatlar tarafından dephosphorylated, sırasıyla. IPS, proteinlere bağlanan ve düzenleyici fonksiyonları destekleyen çözünebilir moleküllerdir. Örneğin, INS (1, 4, 5) Metazoan P3 IP1 reseptörleri bağlayıcı tarafından ikinci bir haberci olarak hareket edebilir, hangi reseptör Konformasyonel değişiklikleri ve böylece CA serbest bırakmak2 + hücre içi mağazalardan11. INS (1, 3, 4, 5) P4 histon deasetilaz kompleksine bağlanır ve protein kompleksi montajı ve aktivite13düzenler. IPS düzenleyici fonksiyon diğer örnekler kromatin organizasyon21, RNA taşıma22,23, RNA düzenleme24ve transkripsiyon1,2,3 kontrolü içerir . Buna karşılık, genellikle plazma membranı veya organel membranlara protein alımı ile ilişkilidir25. Ancak, ‘in gelişmekte olan bir özelliği, membran olmayan bir ortamda proteinleri ile ilişkilendirmek için yeteneğidir3,15,19,26. Bu nükleer reseptör steroidojenik faktör olduğunu, hangi transkripsiyonel kontrol fonksiyonu Pi tarafından düzenlenir (3, 4, 5) P319, ve poli-A polimeraz hangi enzimatik aktivite nükleer PI tarafından düzenlenir (4, 5) P226. IP ‘ler ve için bir düzenleyici rol Maya22,27, mammalin hücreleri19,23, Drosophila10 ve Worms28dahil olmak üzere birçok organizmalarda gösterildi. Önemli olan bu metabolitlerin Tripanozomlar içinde rolüdür, bu da erken ökaryotik soydan uzaklaşır. Bu metabolitler tripanosoma brucei transkripsiyonel kontrol1,3, geliştirme8, organel Biyogenez ve protein trafiği önemli bir rol oynar29,30 , 31 , 32ve aynı zamanda patojenler T. cruzi33,34,35, Toxoplasma36 ve Plasmodium geliştirme ve enfeksiyon kontrol dahil edilir 5 , 37. bu nedenle, tripanosomlar içinde IPS ve rolünü anlamak bu moleküller için yeni biyolojik fonksiyon aydınlatmak ve Roman uyuşturucu hedeflerini belirlemek için yardımcı olabilir.

Protein ve IP veya PI bağlamanın özgüllüğü, protein etkileşimindeki etki alanlarına ve Inositol13‘ün fosforilasyon durumuna bağlıdır,38, Ayrıca, lipid parçası ile etkileşimler de19oluşur. Çeşitli IPS ve ve onların değiştirme kinazlar ve fosfatları metabolit kullanılabilirliği ve bolluk, inositol fosforilasyon durumu ve protein etkilenir protein fonksiyonunu kontrol etmek için esnek bir hücresel mekanizma sağlar etkileşimin benzeşimi1,3,13,38. Bazı protein alanları iyi karakterize olmasına rağmen39,40,41, örn., pleckstrin Homoloji Domain42 ve SPX (SYG1/Pho81/XPR1) Domains43 ,44,45, bazı proteinler IPS veya ile bilinmeyen mekanizmalar tarafından etkileşimde. Örneğin, T. brucei ‘nin baskıcı aktivatör proteini 1 (RAP1) standart Pi-bağlayıcı etki alanlarına sahip değildir, ancak Pi (3, 4, 5) P3 ile etkileşime girer ve antijenik varyasyona katılan genlerin kontrol transkripsiyonu3. Trypanosome, Maya veya memelilerin hücrelerinden IP veya Pi etkileşen proteinlerin benzeşme Kromatografi ve kütle spektrometresi analizi, bilinen IP veya PI bağlama etki alanları olmadan çeşitli proteinleri tespit etti8,46, 47. Data, bu metabolitleri bağlayan ek karakterize olmayan protein alanları önerir. Bu nedenle, IPS veya ile etkileşim proteinlerin tanımlanması, bu küçük moleküller için protein-metabolit etkileşimi ve yeni hücresel düzenleyici fonksiyonların roman mekanizmaları ortaya çıkarabilir.

Burada açıklanan yöntem, IPS veya ‘e bağlanan proteinleri belirlemek için Batı blo, veya kütle spektrometresi ile birleşen benzeşme Kromatografi kullanır. Bu ya da çapraz bağlı streptavidin agaroz boncuk ya da alternatif olarak, streptavidin-konjuik manyetik boncuklar üzerinden yakalanan konjuik olan biyotinlenmiş IPS veya kullanır (Şekil 1). Bu yöntem, hassas, radyoaktif olmayan, Liposome içermeyen basit bir iş akışını sağlar ve proteinlerin hücre endoglikozidazları veya arıtılmış proteinleri3 ‘ü (Şekil 2) bağlamasını tespit etmek için uygundur. Yöntem, etiket içermeyen8,46 veya karmaşık biyolojik örneklerden IP veya PI bağlama proteinlerini tanımlamak için amino asit etiketli nicel Kütle Spektrometrisi47 ile birleştiğinde kullanılabilir. Bu nedenle, bu yöntem birkaç Yöntemler hücresel proteinleri ile IPS veya etkileşimi incelemek için kullanılabilir bir alternatiftir ve bu metabolitlerin tripanosomlar ve belki de diğer Ökaryotlar düzenleyici işlevini anlamada yardımcı olacaktır.

Protocol

1. yakınlık Kromatografi ve Batı lekeleme tarafından IP-veya PI-bağlayıcı proteinlerin Analizi Hücre büyümesi, lizis ve yakınlık Kromatografi Orta günlük faz ve monitör hücre canlılığı ve yoğunluk T. brucei hücreleri büyümek. Toplam 5,0 x 107 hücre bir bağlayıcı tahlil için yeterlidir. Kan akışı formları için, 37 °C ve% 5 CO2′ de% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile takviye edilen HMI-9 medyadaki hücreleri büyü…

Representative Results

RAP1 ve PI Analizi (3, 4, 5) yakınlık Kromatografi ve Batı lekesi ile P3 etkileşimiBu örnek, RAP1 tarafından t. brucei lysate veya rekombinant t. brucei RAP1 proteini tarafından bağlama çözümlemek için bu yöntemin uygulama gösterilmektedir. Hemagglutinin (HA) ifade eden T. brucei kan akışı formları Lysates-RAP1 etiketli bağlayıcı olarak kullanıldı. RAP1 varyant yüzey glikoprotein transkripsiyonel kontrol dahil olan bir protein (VSG) genler<sup class=…

Discussion

IPS veya ‘e bağlanan proteinlerin tanımlanması, bu metabolitlerin hücresel fonksiyonunu anlamak için önemlidir. Batı leke veya kütle spektrometresi ile bağlantılı benzeşme kromatografi, IP veya PI etkileşimi olan proteinlerin belirlenmesi ve dolayısıyla düzenleyici fonksiyonları hakkında öngörüler elde etmek için bir fırsat sunar. IPS veya kimyasal olarak etiketlenmiş [örn., INS (1, 4, 5) P3 kimyasal olarak biotin bağlı] ve streptavidin yoluyla agaroz boncuklar için çapraz bağlı veya strept…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma Doğal Bilimler ve Kanada Mühendislik Araştırma Konseyi (NSERC, RGPIN-2019-04658) tarafından destekleniyordu; Erken kariyer araştırmacılar için NSERC Discovery fırlatma eki (DGECR-2019-00081) ve McGill Üniversitesi tarafından.

Materials

Acetone Sigma-Aldrich 650501 Ketone
Acetonitrile Sigma-Aldrich 271004 Solvent 
Ammonium bicarbonate Sigma-Aldrich A6141 Inorganic salt
Centrifuge Avanti J6-MI Beckman Coulter Avanti J6-MI Centrifuge for large volumes (e.g., 1L)
Centrifuge botles Sigma-Aldrich B1408 Bottles for centrifugation of 1L of culture
Control Beads Echelon P-B000-1ml Affinity chromatography reagent – control
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G8270 Sugar, Added in PBS to keep cells viable
Dithiothreitol (DTT)  Bio-Rad 1610610 Reducing agent
Dynabeads M-270 Streptavidin ThermoFisher Scientific 65305 Streptavidin beads for binding to biotin ligands
EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Roche 11836170001 Protease inhibitors
Electrophoresis running buffer Bio-Rad 1610732 25 mM Tris, 192 mM glycine, 0.1% SDS, pH 8.3
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes Corning Life Sciences 430052 To centrifuge 10 mL cultures
Formic acid Sigma-Aldrich 106526 Acid
Glycine Sigma-Aldrich G7126 Amino acid
HMI-9 cell culture medium ThermoFisher Scientific ME110145P1 Cell culture medium for T. brucei bloodstream forms
Imperial Protein Stain ThermoFisher Scientific 24615 Coomassie staining for protein detection in SDS/PAGE
Ins(1,4,5)P3 Beads Echelon Q-B0145-1ml Affinity chromatography reagent 
Instant Nonfat Dry Milk Thomas Scientific C837M64 Blocking reagent for Western blotting
Iodoacetamide Sigma-Aldrich I6125 Alkylating reagent for cysteine proteins or peptides
Lab Rotator Thomas Scientific 1159Z92 For binding assays
LoBind Microcentrifuge Tubes ThermoFisher Scientific 13-698-793 Low protein binding tubes for mass spectrometry
Nonidet P-40 (Igepal CA-630) Sigma-Aldrich 21-3277 Detergent
PBS, pH 7.4 ThermoFisher Scientific 10010031 Physiological buffer
Peroxidase substrate for chemiluminescence ThermoFisher Scientific 32106 Substrate for Western bloting detection of proteins
PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Cocktail Tablets Roche 4906845001 Phosphatase inhibitors
PI(3)P PIP Beads Echelon P-B003a-1ml Affinity chromatography reagent 
PI(3,4)P2 PIP Beads Echelon P-B034a-1ml Affinity chromatography reagent 
PI(3,4,5)P3 diC8 Echelon P-3908-1mg Affinity chromatography reagent 
PI(3,4,5)P3 PIP Beads Echelon P-B345a-1ml Affinity chromatography reagent 
PI(3,5)P2 PIP Beads Echelon P-B035a-1ml Affinity chromatography reagent 
PI(4)P PIP Beads Echelon P-B004a-1ml Affinity chromatography reagent 
PI(4,5)P2 diC8 Echelon P-4508-1mg Affinity chromatography reagent 
PI(4,5)P2 PIP Beads Echelon P-B045a-1ml Affinity chromatography reagent 
PI(5)P PIP Beads Echelon P-B005a-1ml Affinity chromatography reagent 
Ponceau S solution Sigma-Aldrich P7170 Protein staining (0.1% [w/v] in 5% acetic acid)
Potassium hexacyanoferrate(III) Sigma-Aldrich 702587 Potassium salt 
PtdIns PIP Beads Echelon P-B001-1ml Affinity chromatography reagent 
PVDF Membrane Bio-Rad 1620177 For Western blotting 
Refrigerated centrifuge Eppendorf 5910 R Microcentrifuge for small volumes (e.g., 1.5 mL)
Sodium dodecyl sulfate Sigma-Aldrich 862010 Detergent
Sodium thiosulfate Sigma-Aldrich 72049 Chemical 
SpeedVac Vacuum Concentrators ThermoFisher Scientific SPD120-115 Sample concentration (e.g., for mass spectrometry)
T175 flasks for cell culture  ThermoFisher Scientific 159910 To grow 50 mL T. brucei culture
Trypsin, Mass Spectrometry Grade Promega V5280 Trypsin for protein digestion
Urea Sigma-Aldrich U5128 Denaturing reagent
Vortex Fisher Scientific 02-215-418 For mixing reactions
Western blotting transfer buffer Bio-Rad 1610734 25 mM Tris, 192 mM glycine, pH 8.3 with 20% methanol
Whatman 3 mm paper Sigma-Aldrich WHA3030861 Paper for Wester transfer
2-mercaptoethanol (14.2 M) Bio-Rad 1610710 Reducing agent
2x Laemmli Sample Buffer Bio-Rad 161-0737 Protein loading buffer
4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels Bio-Rad 4561094 Gel for protein electrophoresis
4x Laemmli Sample Buffer Bio-Rad 161-0747 Protein loading buffer
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cestari, I., Stuart, K. Inositol phosphate pathway controls transcription of telomeric expression sites in trypanosomes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (21), 2803-2812 (2015).
  2. Odom, A. R., Stahlberg, A., Wente, S. R., York, J. D. A role for nuclear inositol 1,4,5-trisphosphate kinase in transcriptional control. Science. 287 (5460), 2026-2029 (2000).
  3. Cestari, I., McLeland-Wieser, H., Stuart, K. Nuclear Phosphatidylinositol 5-Phosphatase Is Essential for Allelic Exclusion of Variant Surface Glycoprotein Genes in Trypanosomes. Molecular and Cellular Biology. 39 (3), (2019).
  4. Billcliff, P. G., et al. OCRL1 engages with the F-BAR protein pacsin 2 to promote biogenesis of membrane-trafficking intermediates. Molecular Biology of the Cell. 27 (1), 90-107 (2016).
  5. Brochet, M., et al. Phosphoinositide metabolism links cGMP-dependent protein kinase G to essential Ca(2)(+) signals at key decision points in the life cycle of malaria parasites. PLoS Biology. 12 (3), 1001806 (2014).
  6. Azevedo, C., Szijgyarto, Z., Saiardi, A. The signaling role of inositol hexakisphosphate kinases (IP6Ks). Advances in Enzyme Regulation. 51 (1), 74-82 (2011).
  7. Szijgyarto, Z., Garedew, A., Azevedo, C., Saiardi, A. Influence of inositol pyrophosphates on cellular energy dynamics. Science. 334 (6057), 802-805 (2011).
  8. Cestari, I., Anupama, A., Stuart, K. Inositol polyphosphate multikinase regulation of Trypanosoma brucei life stage development. Molecular Biology of the Cell. 29 (9), 1137-1152 (2018).
  9. Bang, S., et al. AMP-activated protein kinase is physiologically regulated by inositol polyphosphate multikinase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (2), 616-620 (2012).
  10. Seeds, A. M., Tsui, M. M., Sunu, C., Spana, E. P., York, J. D. Inositol phosphate kinase 2 is required for imaginal disc development in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (51), 15660-15665 (2015).
  11. Hamada, K., Miyatake, H., Terauchi, A., Mikoshiba, K. IP3-mediated gating mechanism of the IP3 receptor revealed by mutagenesis and X-ray crystallography. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (18), 4661-4666 (2017).
  12. Watson, P. J., et al. Insights into the activation mechanism of class I HDAC complexes by inositol phosphates. Nature Communications. 7, 11262 (2016).
  13. Watson, P. J., Fairall, L., Santos, G. M., Schwabe, J. W. Structure of HDAC3 bound to co-repressor and inositol tetraphosphate. Nature. 481 (7381), 335-340 (2012).
  14. Irvine, R. F. Nuclear lipid signalling. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 4 (5), 349-360 (2003).
  15. Sobol, M., et al. UBF complexes with phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in nucleolar organizer regions regardless of ongoing RNA polymerase I activity. Nucleus. 4 (6), 478-486 (2013).
  16. Nascimbeni, A. C., et al. ER-plasma membrane contact sites contribute to autophagosome biogenesis by regulation of local PI3P synthesis. EMBO Journal. 36 (14), 2018-2033 (2017).
  17. Martin, K. L., Smith, T. K. The myo-inositol-1-phosphate synthase gene is essential in Trypanosoma brucei. Biochemical Society Transactions. 33, 983-985 (2005).
  18. Matsu-ura, T., et al. Cytosolic inositol 1,4,5-trisphosphate dynamics during intracellular calcium oscillations in living cells. Journal of Cell Biology. 173 (5), 755-765 (2006).
  19. Blind, R. D., et al. The signaling phospholipid PIP3 creates a new interaction surface on the nuclear receptor SF-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (42), 15054-15059 (2014).
  20. Lin, A., et al. The LINK-A lncRNA interacts with PtdIns(3,4,5)P3 to hyperactivate AKT and confer resistance to AKT inhibitors. Nature Cell Biology. 19 (3), 238-251 (2017).
  21. Steger, D. J., Haswell, E. S., Miller, A. L., Wente, S. R., O’Shea, E. K. Regulation of chromatin remodeling by inositol polyphosphates. Science. 299 (5603), 114-116 (2003).
  22. York, J. D., Odom, A. R., Murphy, R., Ives, E. B., Wente, S. R. A phospholipase C-dependent inositol polyphosphate kinase pathway required for efficient messenger RNA export. Science. 285 (5424), 96-100 (1999).
  23. Adams, R. L., Mason, A. C., Glass, L., Aditi, S. R., Wente, Nup42 and IP6 coordinate Gle1 stimulation of Dbp5/DDX19B for mRNA export in yeast and human cells. Traffic. 18 (12), 776-790 (2017).
  24. Macbeth, M. R., et al. Inositol hexakisphosphate is bound in the ADAR2 core and required for RNA editing. Science. 309 (5740), 1534-1539 (2005).
  25. Dickson, E. J., Hille, B. Understanding phosphoinositides: rare, dynamic, and essential membrane phospholipids. Biochemical Journal. 476 (1), 1-23 (2019).
  26. Mellman, D. L., et al. A PtdIns4,5P2-regulated nuclear poly(A) polymerase controls expression of select mRNAs. Nature. 451 (7181), 1013-1017 (2008).
  27. Lee, Y. S., Mulugu, S., York, J. D., O’Shea, E. K. Regulation of a cyclin-CDK-CDK inhibitor complex by inositol pyrophosphates. Science. 316 (5821), 109-112 (2007).
  28. Nagy, A. I., et al. IP3 signalling regulates exogenous RNAi in Caenorhabditis elegans. EMBO Reports. 16 (3), 341-350 (2015).
  29. Hall, B. S., et al. TbVps34, the trypanosome orthologue of Vps34, is required for Golgi complex segregation. Journal of Biological Chemistry. 281 (37), 27600-27612 (2006).
  30. Rodgers, M. J., Albanesi, J. P., Phillips, M. A. Phosphatidylinositol 4-kinase III-beta is required for Golgi maintenance and cytokinesis in Trypanosoma brucei. Eukaryotic Cell. 6 (7), 1108-1118 (2007).
  31. Gilden, J. K., et al. The role of the PI(3,5)P2 kinase TbFab1 in endo/lysosomal trafficking in Trypanosoma brucei. Molecular and Biochemical Parasitology. 214, 52-61 (2017).
  32. Demmel, L., et al. The endocytic activity of the flagellar pocket in Trypanosoma brucei is regulated by an adjacent phosphatidylinositol phosphate kinase. Journal of Cell Science. 129 (11), 2285 (2016).
  33. Gimenez, A. M., et al. Phosphatidylinositol kinase activities in Trypanosoma cruzi epimastigotes. Molecular and Biochemical Parasitology. 203 (1-2), 14-24 (2015).
  34. Hashimoto, M., et al. Inositol 1,4,5-trisphosphate receptor regulates replication, differentiation, infectivity and virulence of the parasitic protist Trypanosoma cruzi. Molecular Microbiology. 87 (6), 1133-1150 (2013).
  35. Cestari, I., Haas, P., Moretti, N. S., Schenkman, S., Stuart, K. Chemogenetic Characterization of Inositol Phosphate Metabolic Pathway Reveals Druggable Enzymes for Targeting Kinetoplastid Parasites. Cell Chemical Biology. 23 (5), 608-617 (2016).
  36. Lovett, J. L., Marchesini, N., Moreno, S. N., Sibley, L. D. Toxoplasma gondii microneme secretion involves intracellular Ca(2+) release from inositol 1,4,5-triphosphate (IP(3))/ryanodine-sensitive stores. Journal of Biological Chemistry. 277 (29), 25870-25876 (2002).
  37. McNamara, C. W., et al. Targeting Plasmodium PI(4)K to eliminate malaria. Nature. 504 (7479), 248-253 (2013).
  38. Tresaugues, L., et al. Structural basis for phosphoinositide substrate recognition, catalysis, and membrane interactions in human inositol polyphosphate 5-phosphatases. Structure. 22 (5), 744-755 (2014).
  39. Varnai, P., et al. Quantifying lipid changes in various membrane compartments using lipid binding protein domains. Cell Calcium. 64, 72-82 (2017).
  40. Lystad, A. H., Simonsen, A. Phosphoinositide-binding proteins in autophagy. FEBS Letters. 590 (15), 2454-2468 (2016).
  41. Cullen, P. J., Cozier, G. E., Banting, G., Mellor, H. Modular phosphoinositide-binding domains–their role in signalling and membrane trafficking. Current Biology. 11 (21), 882-893 (2001).
  42. Klarlund, J. K., et al. Signaling by phosphoinositide-3,4,5-trisphosphate through proteins containing pleckstrin and Sec7 homology domains. Science. 275 (5308), 1927-1930 (1997).
  43. Wild, R., et al. Control of eukaryotic phosphate homeostasis by inositol polyphosphate sensor domains. Science. 352 (6288), 986-990 (2016).
  44. Gerasimaite, R., et al. Inositol Pyrophosphate Specificity of the SPX-Dependent Polyphosphate Polymerase VTC. ACS Chemical Biology. 12 (3), 648-653 (2017).
  45. Potapenko, E., et al. 5-Diphosphoinositol pentakisphosphate (5-IP7) regulates phosphate release from acidocalcisomes and yeast vacuoles. Journal of Biological Chemistry. 293 (49), 19101-19112 (2018).
  46. Wu, M., Chong, L. S., Perlman, D. H., Resnick, A. C., Fiedler, D. Inositol polyphosphates intersect with signaling and metabolic networks via two distinct mechanisms. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (44), 6757-6765 (2016).
  47. Jungmichel, S., et al. Specificity and commonality of the phosphoinositide-binding proteome analyzed by quantitative mass spectrometry. Cell Reports. 6 (3), 578-591 (2014).
  48. Yang, X., Figueiredo, L. M., Espinal, A., Okubo, E., Li, B. RAP1 is essential for silencing telomeric variant surface glycoprotein genes in Trypanosoma brucei. Cell. 137 (1), 99-109 (2009).
  49. Cestari, I., Stuart, K. Transcriptional Regulation of Telomeric Expression Sites and Antigenic Variation in Trypanosomes. Current Genomics. 19 (2), 119-132 (2018).
  50. Clough, T., Thaminy, S., Ragg, S., Aebersold, R., Vitek, O. Statistical protein quantification and significance analysis in label-free LC-MS experiments with complex designs. BMC Bioinformatics. 13, 6 (2012).
  51. Schneider, A., Charriere, F., Pusnik, M., Horn, E. K. Isolation of mitochondria from procyclic Trypanosoma brucei. Methods in Molecular Biology. 372, 67-80 (2007).
  52. DeGrasse, J. A., Chait, B. T., Field, M. C., Rout, M. P. High-yield isolation and subcellular proteomic characterization of nuclear and subnuclear structures from trypanosomes. Methods in Molecular Biology. 463, 77-92 (2008).
  53. Opperdoes, F. R. A rapid method for the isolation of intact glycosomes from Trypanosoma brucei by Percoll -gradient centrifugation in a vertical rotor. Molecular and Biochemical Parasitology. 3 (3), 181-186 (1981).
  54. Pereira, N. M., de Souza, W., Machado, R. D., de Castro, F. T. Isolation and properties of flagella of trypanosomatids. The Journal of protozoology. 24 (4), 511-514 (1977).
  55. Subota, I., et al. Proteomic analysis of intact flagella of procyclic Trypanosoma brucei cells identifies novel flagellar proteins with unique sub-localization and dynamics. Molecular and Cellular Proteomics. 13 (7), 1769-1786 (2014).
  56. Fukuda, M., Kojima, T., Kabayama, H., Mikoshiba, K. Mutation of the pleckstrin homology domain of Bruton’s tyrosine kinase in immunodeficiency impaired inositol 1,3,4,5-tetrakisphosphate binding capacity. Journal of Biological Chemistry. 271 (48), 30303-30306 (1996).
  57. Knodler, A., Mayinger, P. Analysis of phosphoinositide-binding proteins using liposomes as an affinity matrix. BioTechniques. 38 (6), (2005).
  58. Best, M. D. Global approaches for the elucidation of phosphoinositide-binding proteins. Chemistry and Physics of Lipids. 182, 19-28 (2014).

Tags

Inositol PhosphatePhosphoinositideProtein BindingAffinity ChromatographyWestern BlotMass SpectrometryRegulatory FunctionSignal TransductionCell DevelopmentBiotinylatedLyposome FreeT. BruceiPBS-GLysis BufferProtease InhibitorPhosphatase InhibitorBinding Assay

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Cestari, I. Identification of Inositol Phosphate or Phosphoinositide Interacting Proteins by Affinity Chromatography Coupled to Western Blot or Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (149), e59865, doi:10.3791/59865 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image