JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
生物化学

Идентификация фосфата инозитола или фосфонинозидных взаимодействующих белков по хроматографии Affinity в сочетании с Западной погреловой или масс-спектрометрией

Published: July 26, 2019
doi:
10.3791/59865
1Institute of Parasitology,McGill University

Summary

Этот протокол фокусируется на выявлении белков, которые связываются с фосфатами инозитол или фосфоинозитами. Он использует сродство хроматографии с биоинтинилатами инозитол фосфатов или фосфоинозитидов, которые обездвижены через стрептавидин агароз или магнитные бусы. Инозитол фосфат или фосфоинозид связывающие белки идентифицируются западной blotting или масс-спектрометрии.

Abstract

Фосфаты инозитол и фосфоинозиты регулируют несколько клеточных процессов в эукариотах, включая экспрессию генов, торговлю везикулами, трансдукцию сигналов, обмен веществ и развитие. Эти метаболиты выполняют эту регулятивную деятельность путем связывания с белками, тем самым изменяя конформацию белка, каталитическую активность и/или взаимодействия. Метод, описанный здесь, использует сродство хроматографии в сочетании с масс-спектрометрии или западной blotting для выявления белков, которые взаимодействуют с фосфатами инозитол или фосфоинозитидов. Инозитол фосфатов или фосфоинозитидов химически помечены биотин, который затем захватили с помощью стрептавидина сопряжены с агарозили и магнитных бусин. Белки изолированы их сродством связывания с метаболитом, затем eluted и определены масс-спектрометрии или западной blotting. Метод имеет простой рабочий процесс, который является чувствительным, нерадиоактивным, липосомы свободной, и настраиваемый, поддерживая анализ белка и метаболита взаимодействия с точностью. Этот подход может быть использован в без этике или в методах количественной спектрометрии, маркированных аминокислотами, для выявления белково-метаболитных взаимодействий в сложных биологических образцах или с использованием очищенных белков. Этот протокол оптимизирован для анализа белков из trypanosoma brucei,но он может быть адаптирован к родственным простейшие паразиты, дрожжи или млекопитающих клеток.

Introduction

Инозитол фосфатов (IPs) и фосфоинозитидов (PIs) играют центральную роль в биологии эукариот через регулирование клеточных процессов, таких как контроль экспрессии генов1,2,3, везикул торговли 4,трансдукция сигнала 5,6,метаболизм7,8,9,и развитие8,10. Регулирующая функция этих метаболитов является результатом их способности взаимодействовать с белками и, таким образом, регулировать функцию белка. При связывании белками, ИС и ИП могут изменять конформацию белка11,каталитической активности12,или взаимодействия13 и, следовательно, влияют на клеточную функцию. ИП и ИП распределены в нескольких субклеточныхотсеках, таких как ядро 2,3,14,15,эндоплазмический ретикулум16,17,плазма мембрана1 и цитозол18, либо связанные с белками3,19 или с РНК20.

Расщепление мембраны, связанных PI (4,5)P2 фосфолипасы C приводит к освобождению Ins (1,4,5)P3, которые могут быть фосфорилированы или дефосфорилированы IP киназы и фосфатазы, соответственно. ИП являются растворимыми молекулами, которые могут связываться с белками и осуществлять регулятивные функции. Например, Ins (1,4,5)P3 в метазоане может выступать в качестве второго посланника, связывая с рецепторами IP3, что вызывает конформанформальные изменения рецепторов и, таким образом, высвобождение Ca2 “из внутриклеточных магазинов11. Ins (1,3,4,5)P4 связывается с комплексом деацетилазы гистона и регулирует сборку белкового комплекса и деятельность13. Другие примеры IPs регулирующая функция включают контроль хроматина организации21, РНК транспорт22,23, РНК редактирования24, и транскрипции1,2,3 . В отличие от этого, ИП часто связаны с набором белков в плазменную мембрану или органеллы мембраны25. Тем не менее, возникающим свойством ИП является способность ассоциироваться с белками в не-мембранной среде3,15,19,26. Это случай ядерного рецептора стероидогенный фактор, который транскрипционной функции управления регулируется PI (3,4,5)P319, и поли-Полимеразы, которая ферментативная деятельность регулируется ядерной PI (4,5)P226. Регулирующая роль для ИС и ИП была показана во многих организмах, включая дрожжи22,27, клетки млекопитающих19,23, Drosophila10 и червей28. Значение имеет роль этих метаболитов в трипаносомы, которые рано расходились от эукариотической линии. Эти метаболиты играют важную роль в Trypanosoma brucei транскрипционного контроля1,3, развитие8, органеллы биогенеза и протеинового движения29,30 , 31 год , 32, а также участвуют в контроле развития и инфекции в патогенных микроорганизмов T. cruzi33,34,35,Токсоплазма36 и Плазмодиум 5 , 37. Таким образом, понимание роли ИС и ИП в трипаносомы может помочь выяснить новую биологическую функцию для этих молекул и определить новые цели наркотиков.

Специфика связывания белка и IP или PI зависит от взаимодействующих доменов белка и состояния фосфорилирования инозитол13,38, хотя взаимодействие с липидной частью ИП также происходит19. Разнообразие ИП и ИП и их изменение киназы и фосфатазы обеспечивает гибкий клеточный механизм для контроля функции белка, который зависит от наличия метаболита и изобилия, состояние фосфорилирования инозитол, и белок сродство взаимодействия1,3,13,38. Хотя некоторые белковые домены хорошо характеризуются39,40,41, например, плекстрин гомологический домен42 и SPX (SYG1/Pho81/XPR1) домены43 ,44,45, некоторые белки взаимодействуют с ИП или ИП механизмами, которые остаются неизвестными. Например, протеин репрессор-активатор 1 (RAP1) T. brucei не имеет канонических PI-связывающих доменов, но взаимодействует с PI (3,4,5)P3 и контролирует транскрипцию генов, участвующих в антигенной вариации3. Хроматография сродства и масс-спектрометрия анализ IP или PI взаимодействующих белков из трипаносомы, дрожжей или млекопитающих клеток определили несколько белков без известных IP- или PI-связывающих доменов8,46, 47. Данные свидетельствуют о дополнительных нехарактерных белковых доменах, которые связываются с этими метаболитами. Таким образом, выявление белков, которые взаимодействуют с ИС или ИП может выявить новые механизмы взаимодействия белково-метаболита и новые клеточные регуляторные функции для этих малых молекул.

Метод, описанный здесь, использует хроматографию сродства в сочетании с западной блоттингом или масс-спектрометрией для выявления белков, которые связываются с ИП или ИП. Он использует биоинтинилатированных ИП или ИП, которые либо кросс-связанные стрептавидин спряжение с агарозными бусинами или же, захваченных через стрептавидин-конъюгированные магнитные бусы (Рисунок 1). Метод обеспечивает простой рабочий процесс, который является чувствительным, нерадиоактивным, липосомы бесплатно и подходит для обнаружения связывания белков из клеточных лисатов или очищенных белков3 (Рисунок 2). Метод может быть использован вбез этикетке 8,46 или в сочетании с аминокислотой маркировки количественной масс-спектрометрии47 для выявления ИС или PI-связывающих белков из сложных биологических образцов. Таким образом, этот метод является альтернативой несколько методов, доступных для изучения взаимодействия ИС или ИП с клеточными белками и поможет в понимании регулирующую функцию этих метаболитов в трипаносомы и, возможно, другие эукариоты.

Protocol

1. Анализ IP- или PI-связывающих белков по хроматографии сродства и западной промойки Рост клеток, лиза и хроматография сродства Выращивайте клетки T. brucei до середины бревенчатого этапа и контролируйте жизнеспособность и плотность клеток. В общей сложности 5,0 х 10…

Representative Results

Анализ RAP1 и PI (3,4,5)P3 взаимодействия сродства хроматографии и западной blottingЭтот пример иллюстрирует применение этого метода для анализа связывания ИП RAP1 от T. brucei lysate или рекомбинантным белком T. brucei RAP1. В связывающих анализах использовались личицы форм крови T. brucei, …

Discussion

Идентификация белков, которые связываются с ИС или ИП имеет решающее значение для понимания клеточной функции этих метаболитов. Хроматография сродства в сочетании с западной помоткой или масс-спектрометрией дает возможность определить взаимодействующие белки ИС или ИП и, следовател?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана Советом по естественным наукам и инженерным исследованиям Канады (NSERC, RGPIN-2019-04658); NSERC Discovery Launch Supplement для исследователей ранней карьеры (DGECR-2019-00081) и Университета Макгилла.

Materials

Acetone Sigma-Aldrich 650501 Ketone
Acetonitrile Sigma-Aldrich 271004 Solvent 
Ammonium bicarbonate Sigma-Aldrich A6141 Inorganic salt
Centrifuge Avanti J6-MI Beckman Coulter Avanti J6-MI Centrifuge for large volumes (e.g., 1L)
Centrifuge botles Sigma-Aldrich B1408 Bottles for centrifugation of 1L of culture
Control Beads Echelon P-B000-1ml Affinity chromatography reagent – control
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G8270 Sugar, Added in PBS to keep cells viable
Dithiothreitol (DTT)  Bio-Rad 1610610 Reducing agent
Dynabeads M-270 Streptavidin ThermoFisher Scientific 65305 Streptavidin beads for binding to biotin ligands
EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Roche 11836170001 Protease inhibitors
Electrophoresis running buffer Bio-Rad 1610732 25 mM Tris, 192 mM glycine, 0.1% SDS, pH 8.3
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes Corning Life Sciences 430052 To centrifuge 10 mL cultures
Formic acid Sigma-Aldrich 106526 Acid
Glycine Sigma-Aldrich G7126 Amino acid
HMI-9 cell culture medium ThermoFisher Scientific ME110145P1 Cell culture medium for T. brucei bloodstream forms
Imperial Protein Stain ThermoFisher Scientific 24615 Coomassie staining for protein detection in SDS/PAGE
Ins(1,4,5)P3 Beads Echelon Q-B0145-1ml Affinity chromatography reagent 
Instant Nonfat Dry Milk Thomas Scientific C837M64 Blocking reagent for Western blotting
Iodoacetamide Sigma-Aldrich I6125 Alkylating reagent for cysteine proteins or peptides
Lab Rotator Thomas Scientific 1159Z92 For binding assays
LoBind Microcentrifuge Tubes ThermoFisher Scientific 13-698-793 Low protein binding tubes for mass spectrometry
Nonidet P-40 (Igepal CA-630) Sigma-Aldrich 21-3277 Detergent
PBS, pH 7.4 ThermoFisher Scientific 10010031 Physiological buffer
Peroxidase substrate for chemiluminescence ThermoFisher Scientific 32106 Substrate for Western bloting detection of proteins
PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Cocktail Tablets Roche 4906845001 Phosphatase inhibitors
PI(3)P PIP Beads Echelon P-B003a-1ml Affinity chromatography reagent 
PI(3,4)P2 PIP Beads Echelon P-B034a-1ml Affinity chromatography reagent 
PI(3,4,5)P3 diC8 Echelon P-3908-1mg Affinity chromatography reagent 
PI(3,4,5)P3 PIP Beads Echelon P-B345a-1ml Affinity chromatography reagent 
PI(3,5)P2 PIP Beads Echelon P-B035a-1ml Affinity chromatography reagent 
PI(4)P PIP Beads Echelon P-B004a-1ml Affinity chromatography reagent 
PI(4,5)P2 diC8 Echelon P-4508-1mg Affinity chromatography reagent 
PI(4,5)P2 PIP Beads Echelon P-B045a-1ml Affinity chromatography reagent 
PI(5)P PIP Beads Echelon P-B005a-1ml Affinity chromatography reagent 
Ponceau S solution Sigma-Aldrich P7170 Protein staining (0.1% [w/v] in 5% acetic acid)
Potassium hexacyanoferrate(III) Sigma-Aldrich 702587 Potassium salt 
PtdIns PIP Beads Echelon P-B001-1ml Affinity chromatography reagent 
PVDF Membrane Bio-Rad 1620177 For Western blotting 
Refrigerated centrifuge Eppendorf 5910 R Microcentrifuge for small volumes (e.g., 1.5 mL)
Sodium dodecyl sulfate Sigma-Aldrich 862010 Detergent
Sodium thiosulfate Sigma-Aldrich 72049 Chemical 
SpeedVac Vacuum Concentrators ThermoFisher Scientific SPD120-115 Sample concentration (e.g., for mass spectrometry)
T175 flasks for cell culture  ThermoFisher Scientific 159910 To grow 50 mL T. brucei culture
Trypsin, Mass Spectrometry Grade Promega V5280 Trypsin for protein digestion
Urea Sigma-Aldrich U5128 Denaturing reagent
Vortex Fisher Scientific 02-215-418 For mixing reactions
Western blotting transfer buffer Bio-Rad 1610734 25 mM Tris, 192 mM glycine, pH 8.3 with 20% methanol
Whatman 3 mm paper Sigma-Aldrich WHA3030861 Paper for Wester transfer
2-mercaptoethanol (14.2 M) Bio-Rad 1610710 Reducing agent
2x Laemmli Sample Buffer Bio-Rad 161-0737 Protein loading buffer
4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels Bio-Rad 4561094 Gel for protein electrophoresis
4x Laemmli Sample Buffer Bio-Rad 161-0747 Protein loading buffer
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cestari, I., Stuart, K. Inositol phosphate pathway controls transcription of telomeric expression sites in trypanosomes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (21), 2803-2812 (2015).
  2. Odom, A. R., Stahlberg, A., Wente, S. R., York, J. D. A role for nuclear inositol 1,4,5-trisphosphate kinase in transcriptional control. Science. 287 (5460), 2026-2029 (2000).
  3. Cestari, I., McLeland-Wieser, H., Stuart, K. Nuclear Phosphatidylinositol 5-Phosphatase Is Essential for Allelic Exclusion of Variant Surface Glycoprotein Genes in Trypanosomes. Molecular and Cellular Biology. 39 (3), (2019).
  4. Billcliff, P. G., et al. OCRL1 engages with the F-BAR protein pacsin 2 to promote biogenesis of membrane-trafficking intermediates. Molecular Biology of the Cell. 27 (1), 90-107 (2016).
  5. Brochet, M., et al. Phosphoinositide metabolism links cGMP-dependent protein kinase G to essential Ca(2)(+) signals at key decision points in the life cycle of malaria parasites. PLoS Biology. 12 (3), 1001806 (2014).
  6. Azevedo, C., Szijgyarto, Z., Saiardi, A. The signaling role of inositol hexakisphosphate kinases (IP6Ks). Advances in Enzyme Regulation. 51 (1), 74-82 (2011).
  7. Szijgyarto, Z., Garedew, A., Azevedo, C., Saiardi, A. Influence of inositol pyrophosphates on cellular energy dynamics. Science. 334 (6057), 802-805 (2011).
  8. Cestari, I., Anupama, A., Stuart, K. Inositol polyphosphate multikinase regulation of Trypanosoma brucei life stage development. Molecular Biology of the Cell. 29 (9), 1137-1152 (2018).
  9. Bang, S., et al. AMP-activated protein kinase is physiologically regulated by inositol polyphosphate multikinase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (2), 616-620 (2012).
  10. Seeds, A. M., Tsui, M. M., Sunu, C., Spana, E. P., York, J. D. Inositol phosphate kinase 2 is required for imaginal disc development in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (51), 15660-15665 (2015).
  11. Hamada, K., Miyatake, H., Terauchi, A., Mikoshiba, K. IP3-mediated gating mechanism of the IP3 receptor revealed by mutagenesis and X-ray crystallography. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (18), 4661-4666 (2017).
  12. Watson, P. J., et al. Insights into the activation mechanism of class I HDAC complexes by inositol phosphates. Nature Communications. 7, 11262 (2016).
  13. Watson, P. J., Fairall, L., Santos, G. M., Schwabe, J. W. Structure of HDAC3 bound to co-repressor and inositol tetraphosphate. Nature. 481 (7381), 335-340 (2012).
  14. Irvine, R. F. Nuclear lipid signalling. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 4 (5), 349-360 (2003).
  15. Sobol, M., et al. UBF complexes with phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in nucleolar organizer regions regardless of ongoing RNA polymerase I activity. Nucleus. 4 (6), 478-486 (2013).
  16. Nascimbeni, A. C., et al. ER-plasma membrane contact sites contribute to autophagosome biogenesis by regulation of local PI3P synthesis. EMBO Journal. 36 (14), 2018-2033 (2017).
  17. Martin, K. L., Smith, T. K. The myo-inositol-1-phosphate synthase gene is essential in Trypanosoma brucei. Biochemical Society Transactions. 33, 983-985 (2005).
  18. Matsu-ura, T., et al. Cytosolic inositol 1,4,5-trisphosphate dynamics during intracellular calcium oscillations in living cells. Journal of Cell Biology. 173 (5), 755-765 (2006).
  19. Blind, R. D., et al. The signaling phospholipid PIP3 creates a new interaction surface on the nuclear receptor SF-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (42), 15054-15059 (2014).
  20. Lin, A., et al. The LINK-A lncRNA interacts with PtdIns(3,4,5)P3 to hyperactivate AKT and confer resistance to AKT inhibitors. Nature Cell Biology. 19 (3), 238-251 (2017).
  21. Steger, D. J., Haswell, E. S., Miller, A. L., Wente, S. R., O’Shea, E. K. Regulation of chromatin remodeling by inositol polyphosphates. Science. 299 (5603), 114-116 (2003).
  22. York, J. D., Odom, A. R., Murphy, R., Ives, E. B., Wente, S. R. A phospholipase C-dependent inositol polyphosphate kinase pathway required for efficient messenger RNA export. Science. 285 (5424), 96-100 (1999).
  23. Adams, R. L., Mason, A. C., Glass, L., Aditi, S. R., Wente, Nup42 and IP6 coordinate Gle1 stimulation of Dbp5/DDX19B for mRNA export in yeast and human cells. Traffic. 18 (12), 776-790 (2017).
  24. Macbeth, M. R., et al. Inositol hexakisphosphate is bound in the ADAR2 core and required for RNA editing. Science. 309 (5740), 1534-1539 (2005).
  25. Dickson, E. J., Hille, B. Understanding phosphoinositides: rare, dynamic, and essential membrane phospholipids. Biochemical Journal. 476 (1), 1-23 (2019).
  26. Mellman, D. L., et al. A PtdIns4,5P2-regulated nuclear poly(A) polymerase controls expression of select mRNAs. Nature. 451 (7181), 1013-1017 (2008).
  27. Lee, Y. S., Mulugu, S., York, J. D., O’Shea, E. K. Regulation of a cyclin-CDK-CDK inhibitor complex by inositol pyrophosphates. Science. 316 (5821), 109-112 (2007).
  28. Nagy, A. I., et al. IP3 signalling regulates exogenous RNAi in Caenorhabditis elegans. EMBO Reports. 16 (3), 341-350 (2015).
  29. Hall, B. S., et al. TbVps34, the trypanosome orthologue of Vps34, is required for Golgi complex segregation. Journal of Biological Chemistry. 281 (37), 27600-27612 (2006).
  30. Rodgers, M. J., Albanesi, J. P., Phillips, M. A. Phosphatidylinositol 4-kinase III-beta is required for Golgi maintenance and cytokinesis in Trypanosoma brucei. Eukaryotic Cell. 6 (7), 1108-1118 (2007).
  31. Gilden, J. K., et al. The role of the PI(3,5)P2 kinase TbFab1 in endo/lysosomal trafficking in Trypanosoma brucei. Molecular and Biochemical Parasitology. 214, 52-61 (2017).
  32. Demmel, L., et al. The endocytic activity of the flagellar pocket in Trypanosoma brucei is regulated by an adjacent phosphatidylinositol phosphate kinase. Journal of Cell Science. 129 (11), 2285 (2016).
  33. Gimenez, A. M., et al. Phosphatidylinositol kinase activities in Trypanosoma cruzi epimastigotes. Molecular and Biochemical Parasitology. 203 (1-2), 14-24 (2015).
  34. Hashimoto, M., et al. Inositol 1,4,5-trisphosphate receptor regulates replication, differentiation, infectivity and virulence of the parasitic protist Trypanosoma cruzi. Molecular Microbiology. 87 (6), 1133-1150 (2013).
  35. Cestari, I., Haas, P., Moretti, N. S., Schenkman, S., Stuart, K. Chemogenetic Characterization of Inositol Phosphate Metabolic Pathway Reveals Druggable Enzymes for Targeting Kinetoplastid Parasites. Cell Chemical Biology. 23 (5), 608-617 (2016).
  36. Lovett, J. L., Marchesini, N., Moreno, S. N., Sibley, L. D. Toxoplasma gondii microneme secretion involves intracellular Ca(2+) release from inositol 1,4,5-triphosphate (IP(3))/ryanodine-sensitive stores. Journal of Biological Chemistry. 277 (29), 25870-25876 (2002).
  37. McNamara, C. W., et al. Targeting Plasmodium PI(4)K to eliminate malaria. Nature. 504 (7479), 248-253 (2013).
  38. Tresaugues, L., et al. Structural basis for phosphoinositide substrate recognition, catalysis, and membrane interactions in human inositol polyphosphate 5-phosphatases. Structure. 22 (5), 744-755 (2014).
  39. Varnai, P., et al. Quantifying lipid changes in various membrane compartments using lipid binding protein domains. Cell Calcium. 64, 72-82 (2017).
  40. Lystad, A. H., Simonsen, A. Phosphoinositide-binding proteins in autophagy. FEBS Letters. 590 (15), 2454-2468 (2016).
  41. Cullen, P. J., Cozier, G. E., Banting, G., Mellor, H. Modular phosphoinositide-binding domains–their role in signalling and membrane trafficking. Current Biology. 11 (21), 882-893 (2001).
  42. Klarlund, J. K., et al. Signaling by phosphoinositide-3,4,5-trisphosphate through proteins containing pleckstrin and Sec7 homology domains. Science. 275 (5308), 1927-1930 (1997).
  43. Wild, R., et al. Control of eukaryotic phosphate homeostasis by inositol polyphosphate sensor domains. Science. 352 (6288), 986-990 (2016).
  44. Gerasimaite, R., et al. Inositol Pyrophosphate Specificity of the SPX-Dependent Polyphosphate Polymerase VTC. ACS Chemical Biology. 12 (3), 648-653 (2017).
  45. Potapenko, E., et al. 5-Diphosphoinositol pentakisphosphate (5-IP7) regulates phosphate release from acidocalcisomes and yeast vacuoles. Journal of Biological Chemistry. 293 (49), 19101-19112 (2018).
  46. Wu, M., Chong, L. S., Perlman, D. H., Resnick, A. C., Fiedler, D. Inositol polyphosphates intersect with signaling and metabolic networks via two distinct mechanisms. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (44), 6757-6765 (2016).
  47. Jungmichel, S., et al. Specificity and commonality of the phosphoinositide-binding proteome analyzed by quantitative mass spectrometry. Cell Reports. 6 (3), 578-591 (2014).
  48. Yang, X., Figueiredo, L. M., Espinal, A., Okubo, E., Li, B. RAP1 is essential for silencing telomeric variant surface glycoprotein genes in Trypanosoma brucei. Cell. 137 (1), 99-109 (2009).
  49. Cestari, I., Stuart, K. Transcriptional Regulation of Telomeric Expression Sites and Antigenic Variation in Trypanosomes. Current Genomics. 19 (2), 119-132 (2018).
  50. Clough, T., Thaminy, S., Ragg, S., Aebersold, R., Vitek, O. Statistical protein quantification and significance analysis in label-free LC-MS experiments with complex designs. BMC Bioinformatics. 13, 6 (2012).
  51. Schneider, A., Charriere, F., Pusnik, M., Horn, E. K. Isolation of mitochondria from procyclic Trypanosoma brucei. Methods in Molecular Biology. 372, 67-80 (2007).
  52. DeGrasse, J. A., Chait, B. T., Field, M. C., Rout, M. P. High-yield isolation and subcellular proteomic characterization of nuclear and subnuclear structures from trypanosomes. Methods in Molecular Biology. 463, 77-92 (2008).
  53. Opperdoes, F. R. A rapid method for the isolation of intact glycosomes from Trypanosoma brucei by Percoll -gradient centrifugation in a vertical rotor. Molecular and Biochemical Parasitology. 3 (3), 181-186 (1981).
  54. Pereira, N. M., de Souza, W., Machado, R. D., de Castro, F. T. Isolation and properties of flagella of trypanosomatids. The Journal of protozoology. 24 (4), 511-514 (1977).
  55. Subota, I., et al. Proteomic analysis of intact flagella of procyclic Trypanosoma brucei cells identifies novel flagellar proteins with unique sub-localization and dynamics. Molecular and Cellular Proteomics. 13 (7), 1769-1786 (2014).
  56. Fukuda, M., Kojima, T., Kabayama, H., Mikoshiba, K. Mutation of the pleckstrin homology domain of Bruton’s tyrosine kinase in immunodeficiency impaired inositol 1,3,4,5-tetrakisphosphate binding capacity. Journal of Biological Chemistry. 271 (48), 30303-30306 (1996).
  57. Knodler, A., Mayinger, P. Analysis of phosphoinositide-binding proteins using liposomes as an affinity matrix. BioTechniques. 38 (6), (2005).
  58. Best, M. D. Global approaches for the elucidation of phosphoinositide-binding proteins. Chemistry and Physics of Lipids. 182, 19-28 (2014).

Tags

Inositol PhosphatePhosphoinositideProtein BindingAffinity ChromatographyWestern BlotMass SpectrometryRegulatory FunctionSignal TransductionCell DevelopmentBiotinylatedLyposome FreeT. BruceiPBS-GLysis BufferProtease InhibitorPhosphatase InhibitorBinding Assay

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Cestari, I. Identification of Inositol Phosphate or Phosphoinositide Interacting Proteins by Affinity Chromatography Coupled to Western Blot or Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (149), e59865, doi:10.3791/59865 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image