Identificazione delle proteine che interagiscono con fosfato inositolo o fosfonositide mediante matricografia affinità accoppiata a Blot occidentale o spettrometria di massa

I fosfati inositoli (IP) e le fosfoinosti (PI) svolgono un ruolo centrale nella biologia degli eucarioti attraverso la regolazione dei processi cellulari come il controllo dell’espressione genica^1,2,3, il traffico di vescicocchi ⁴, trasduzione del segnale^5,6, metabolismo^7,8,9, e lo sviluppo^8,10. La funzione regolatoria di questi metaboliti deriva dalla loro capacità di interagire con le proteine e quindi regolare la funzione proteica. Al momento del legame da parte delle proteine, IP e PI possono alterare la conformazione proteica¹¹, l’attività catalitica¹²o le interazioni¹³ e quindi influenzare la funzione cellulare. IP e PI sono distribuiti in più compartimenti subcellulari, come il nucleo^2,3,14,15, reticolo endolasmico^16,17, plasma membrana¹ e citosol¹⁸, associati alle proteine^3,19 o con RNA²⁰.

La scissione del PI(4,5)P2 associato alla membrana dalla fosforaC determina il rilascio di Ins(1,4,5)P3, che può essere fosforilata o dephophorylated da kinasi IP e fosfoforasi, rispettivamente. Gli IP sono molecole solubili che possono legarsi alle proteine ed esercitare funzioni regolatorie. Ad esempio, Ins(1,4,5)P3 in metazoo può agire come un secondo messaggero legandosi ai recettori IP3, che induce i cambiamenti conformazionali del recettore e quindi il rilascio di Ca^2, dai negozi intracellulari¹¹. Ins(1,3,4,5)P4 si lega al complesso della deacetylase istone e regola l’assemblaggio e l’attività complesse di proteine¹³. Altri esempi di funzione regolatrice degli IP includono il controllo dell’organizzazione della cromatina²¹, il trasporto dell’RNA^22,23, l’editing RNA²⁴e la trascrizione^1,2^,3 . Al contrario, i PI sono spesso associati al reclutamento di proteine nella membrana plasmatica o nelle membrane dell’orgelli²⁵. Tuttavia, una proprietà emergente delle PI è la capacità di associarsi alle proteine in un ambiente non-membranoso^3,15,19,26. Questo è il caso del recettore nucleare fattore steroidogenico, che la funzione di controllo trascrizionale è regolata da PI(3,4,5)P3¹⁹, e poli-A polimerasi che l’attività ezimatica è regolata da NUCLEAR PI(4,5)P2²⁶. Un ruolo normativo per IP e PI è stato dimostrato in molti organismi tra cui lievito^22,27, cellule di mammiferi^19,23, Drosophila¹⁰ e vermi²⁸. Di significato è il ruolo di questi metaboliti nei trypanosomi, che si sono differenziati presto dal lignaggio eucarotico. Questi metaboliti svolgono un ruolo essenziale nel trypanosoma brucei controllo trascrizionale^1,3, sviluppo⁸, biogenesi organelle e traffico proteico^{29,30 , 31 Milia , 32}, e sono anche coinvolti nel controllo dello sviluppo e infezione nei patogeni T. cruzi^33,34,35,Toxoplasma³⁶ e Plasmodium ⁵ Del numero 3( ^{, 37}. Quindi, comprendere il ruolo degli IP e dei PI nei trypanosomi può aiutare a chiarire la nuova funzione biologica di queste molecole e a identificare nuovi bersagli farmacologici.

La specificità del legame di proteine e IP o PI dipende dalle proteine che interagiscono tra i domini e lo stato di fosforilazione dell’inositolo^13,38, anche se le interazioni con la parte lipidica delle PI avvengono anche¹⁹. La varietà di IP e PI e la loro modifica di chinasi e fosfolenosi fornisce un meccanismo cellulare flessibile per controllare la funzione proteica che è influenzato dalla disponibilità e dall’abbondanza di metaboliti, dallo stato di fosforolalazione dell’inositolo e dalle proteine affinità di interazione^1,3,13,38. Anche se alcuni domini proteici sono ben caratterizzati^39,40,41, ad esempio, pleckstrin homology dominio⁴² e SPX (SYG1 /Pho81 /XPR1) domini^{43 ,44,45}, alcune proteine interagiscono con IP o PI con meccanismi che rimangono sconosciuti. Ad esempio, la proteina repressore-attivatore 1 (RAP1) di T. brucei manca di domini di legame PI canonici, ma interagisce con PI(3,4,5)P3 e la trascrizione di controllo dei geni coinvolti nella variazione antigenica³. La cromatografia di affinità e l’analisi della spettrometria di massa delle proteine interagenti IP o PI da cellule tripitosomi, lievito o mammiferi hanno identificato diverse proteine senza domini di legame IP o PI noti^{8,46, 47}. I dati suggeriscono ulteriori domini proteici non caratterizzati che si legano a questi metaboliti. Quindi, l’identificazione delle proteine che interagiscono con IP o PI può rivelare nuovi meccanismi di interazione proteina-metabolita e nuove funzioni regolatorie cellulari per queste piccole molecole.

Il metodo qui descritto utilizza la cromatografia di affinità accoppiata alla blotrotazione occidentale o alla spettrometria di massa per identificare le proteine che si legano a IP o PI. Esso utilizza IP biotinylati o PI che sono o cross-linked a streptavidin a perline di agarose o in alternativa, catturato tramite perline magnetiche coniugate streptavidin (Figura 1). Il metodo fornisce un flusso di lavoro semplice, sensibile, non radioattivo, privo di liposomi ed è adatto per rilevare il legame delle proteine da lismi cellulari o proteine purificate³ (Figura 2). Il metodo può essere utilizzato in una spettrometria di massa quantitativa^{da 8,46} o accoppiato a una spettrometria di massa quantitativa con etichetta di aminoacidi⁴⁷ per identificare proteine IP o PI-leganti da campioni biologici complessi. Quindi, questo metodo è un’alternativa ai pochi metodi disponibili per studiare l’interazione di IP o PI con proteine cellulari e aiuterà a comprendere la funzione regolatoria di questi metaboliti nei trypanosomi e forse in altri eucarioti.