Identification du phosphate d'inositol ou du phosphoinositide Protéines interactatrices par chromatographie d'affinité couplée à la fente occidentale ou à la spectrométrie de masse

Les phosphates inositol (IP) et les phosphoinositides (IP) jouent un rôle central dans la biologie de l’eucaryote par la régulation des processus cellulaires tels que le contrôle de l’expression génique^1,2,3, le trafic de vésicule ⁴, transduction de signal^5,6, métabolisme^7,8,9, et le développement^8,10. La fonction de régulation de ces métabolites résulte de leur capacité à interagir avec les protéines et donc à réguler la fonction protéique. Lors de la liaison par les protéines, les IP et les IP peuvent modifier la conformation des protéines¹¹, l’activité catalytique¹², ou les interactions¹³ et donc affecter la fonction cellulaire. Les IP et les IP sont distribués dans plusieurs compartiments subcellulaires, tels que le noyau^2,3,14,15, réticulum endoplasmique^16,17, plasma membrane¹ et cytosol¹⁸, soit associée aux protéines^3,19 ou avec RNAs²⁰.

Le clivage de l’IP associé à la membrane(4,5)P2 par la phospholipase C entraîne la libération d’Ins(1,4,5)P3, qui peut être phosphorylé ou déphosphorylé par des kinases IP et des phosphatases, respectivement. Les ADRESSEs IP sont des molécules solubles qui peuvent se lier aux protéines et exercer des fonctions de régulation. Par exemple, Ins(1,4,5)P3 dans le métazoan peut agir comme un deuxième messager en se liant aux récepteurs IP3, ce qui induit des changements conformationnels des récepteurs et donc la libération de Ca² ‘des magasins intracellulaires¹¹. Ins(1,3,4,5)P4 se lie au complexe histone deacetylase et régule l’assemblage complexe protéique et l’activité¹³. D’autres exemples de fonction réglementaire d’IPs incluent le contrôle de l’organisation de chromatine^21,le transport d’ARN^22,23, l’édition d’ARN^24,et la transcription^1,2,3 . En revanche, les PI sont souvent associés au recrutement de protéines à la membrane plasmatique ou aux membranes d’organites²⁵. Cependant, une propriété émergente des PI est la capacité de s’associer avec des protéines dans un environnement non-membranaire^3,15,19,26. C’est le cas du facteur stéroïdomique de récepteur nucléaire, dont la fonction de contrôle transcriptionnelle est réglée par PI(3,4,5)P3¹⁹, et polymérase polyzymatique qui est réglée par PI nucléaire (4,5)P2²⁶. Un rôle réglementaire pour les IP et les IP a été montré dans de nombreux organismes, y compris la levure^22,27, les cellules des mammifères^19,23, Drosophila¹⁰ et les vers²⁸. Le rôle de ces métabolites dans les trypanosomes, qui s’écartait tôt de la lignée eucaryote, est important. Ces métabolites jouent un rôle essentiel dans trypanosoma brucei contrôle transcriptionnel^1,3, développement⁸, biogenèse organelle et le trafic protéique^{29,30 , 31 Ans,} états-unis ( ^{, 32}, et sont également impliqués dans le contrôle du développement et de l’infection chez les pathogènes T. cruzi^33,34,35,Toxoplasma³⁶ et Plasmodium ^{5 Annonces , 37}. Par conséquent, la compréhension du rôle des IP et des IP dans les trypanosomes peut aider à élucider une nouvelle fonction biologique pour ces molécules et à identifier de nouvelles cibles médicamenteuses.

La spécificité de la protéine et de la liaison IP ou PI dépend des domaines d’interaction des protéines et de l’état de phosphorylation de l’inositol^13,38, bien que les interactions avec la partie lipidique des IP se produisent également¹⁹. La variété des IP et des IP et leurs kinases et phosphatases modifiantes fournit un mécanisme cellulaire flexible pour contrôler la fonction protéique qui est influencée par la disponibilité et l’abondance des métabolites, l’état de phosphorylation de l’inositol et les protéines affinité de l’interaction^1,3,13,38. Bien que certains domaines protéiques soient bien caractérisés^39,40,41, par exemple, domaine d’homologie pleckstrin⁴² et SPX (SYG1/Pho81/XPR1) domaines^{43 ,44,45}, certaines protéines interagissent avec les IP ou LES IP par des mécanismes qui restent inconnus. Par exemple, la protéine répresseur-activateur 1 (RAP1) de T. brucei n’a pas de domaines canoniques de liaison PI mais interagit avec PI(3,4,5)P3 et contrôle la transcription des gènes impliqués dans la variation antigénique³. Chromatographie d’affinité et analyse de spectrométrie de masse des protéines ip ou PI interagissant des cellules trypanosome, levure, ou mammifères ont identifié plusieurs protéines sans domaines IP- ou PI-contraignants connus^{8,46, 47}. Les données suggèrent d’autres domaines protéiques non caractérisés qui se lient à ces métabolites. Par conséquent, l’identification des protéines qui interagissent avec les IP ou les IP peut révéler de nouveaux mécanismes d’interaction protéine-métabolite et de nouvelles fonctions de régulation cellulaire pour ces petites molécules.

La méthode décrite ici utilise la chromatographie d’affinité couplée au ballonnement occidental ou à la spectrométrie de masse pour identifier les protéines qui se lient aux IP ou aux IP. Il utilise des IP biotinylated ou IP qui sont soit reliés à la streptavidine conjuguée à des perles d’agarose ou alternativement, capturés par l’intermédiaire de perles magnétiques conjuguées par streptavidin (figure1). La méthode fournit un flux de travail simple qui est sensible, non radioactif, sans liposome et convient pour détecter la liaison des protéines des lysates cellulaires ou des protéines purifiées³ (Figure 2). La méthode peut être utilisée dans l’étiquette-libre^8,46 ou couplé à la spectrométrie de masse quantitative étiquetée acide aminé⁴⁷ pour identifier la propriété IP ou PI-liaison des protéines à partir d’échantillons biologiques complexes. Par conséquent, cette méthode est une alternative aux quelques méthodes disponibles pour étudier l’interaction des IP ou des IP avec les protéines cellulaires et aidera à comprendre la fonction réglementaire de ces métabolites chez les trypanosomes et peut-être d’autres eucaryotes.