Identificatie van inositol fosfaat of Fosfoinositide interactie eiwitten door Affiniteits chromatografie gekoppeld aan Western Blot of massaspectrometrie

Inositol fosfaten (IPS) en fosfoinositides (pi’s) spelen een centrale rol in de eukaryote biologie door de regulering van cellulaire processen zoals de beheersing van genexpressie^1,2,3, blaasje handel ⁴, signaaltransductie^5,6, metabolisme^7,8,9, en ontwikkeling^8,10. De regelgevende functie van deze metabolieten is het gevolg van hun vermogen om te interageren met eiwitten en zo de eiwit functie te reguleren. Na binding door eiwitten, IPs en Pi’s kunnen eiwit conformatie wijzigen¹¹, katalytische activiteit¹², of interacties¹³ en dus beïnvloeden cellulaire functie. IPS en pi’s worden verdeeld in meerdere subcellulaire compartimenten, zoals Nucleus^2,3,14,15, endoplasmatisch reticulum^16,17, plasma membraan¹ en cytosol¹⁸, ofwel geassocieerd met eiwitten^3,19 of met RNAS²⁰.

Het decolleté van de membraan-geassocieerde PI (4, 5) P2 door fosfolipase C resulteert in de afgifte van ins (1, 4, 5) P3, die kan worden gefosforyleerd of gedefosforyleerd door respectievelijk IP-kinasen en fosfatasen. IPs zijn oplosbare moleculen die kunnen binden aan eiwitten en regelgevende functies uitoefenen. Bijvoorbeeld, ins (1, 4, 5) P3 in metazoan kan fungeren als een tweede boodschapper door binding aan IP3 receptoren, die receptor conformationale veranderingen induceert en dus vrijlating van CA^{2 +} van intracellulaire winkels¹¹. Ins (1, 3, 4, 5) P4 bindt aan het histon deacetylase complex en reguleert het eiwit complex assemblage-en activiteit¹³. Andere voorbeelden van IPS regulerende functie zijn onder andere de controle van chromatine organisatie²¹, RNA transport^22,23, RNA Editing²⁴, en transcriptie^1,2,3 . In tegenstelling, worden pi’s vaak geassocieerd met de werving van eiwitten aan het plasma membraan of organel membranen²⁵. Een opkomende eigenschap van pi’s is echter het vermogen om te associëren met eiwitten in een niet-membraneuze omgeving^3,15,19,26. Dit is het geval van de nucleaire receptor steroidogenic factor, welke transcriptionele controlefunctie wordt gereguleerd door PI (3, 4, 5) P3¹⁹, en poly-A polymerase welke enzymatische activiteit wordt gereguleerd door Nuclear PI (4, 5) P2²⁶. Een regelgevende rol voor IPS en pi’s is aangetoond in vele organismen, waaronder gist^22,27, zoogdiercellen^19,23, Drosophila¹⁰ en Worms²⁸. Van betekenis is de rol van deze metabolieten in trypanosomes, die vroeg van de eukaryotische afstamming afwijken. Deze metabolieten spelen een essentiële rol in Trypanosoma brucei Transcriptionele controle^1,3, ontwikkeling⁸, Organel biogenese en eiwit verkeer^{29,30 , 31 , 32}, en zijn ook betrokken bij het beheersen van de ontwikkeling en infectie in de pathogenen T. cruzi^33,34,35, Toxoplasma³⁶ en Plasmodium ^{5 , 37}. Vandaar dat het begrijpen van de rol van IPS en pi’s in trypanosomen kan helpen om nieuwe biologische functie voor deze moleculen te verhelden en om te bepalen nieuwe geneesmiddel doelen.

De specificiteit van eiwitten en IP of pi binding hangt af van de eiwit-interactie domeinen en de fosforylatie toestand van de inositol^13,38, hoewel interacties met het lipide deel van pi’s ook voorkomt¹⁹. De verscheidenheid van IPs en Pi’s en hun modificerende kinases en fosfatasen biedt een flexibele cellulaire mechanisme voor het beheersen van de eiwit functie die wordt beïnvloed door de beschikbaarheid van de metaboliet en overvloed, de fosforylering staat van de inositol, en eiwitten affiniteit van interactie^1,3,13,38. Hoewel sommige eiwit domeinen goed gekarakteriseerd zijn^39,40,41, bijvoorbeeld, pleckstrin homologie domein⁴² en SPX (SYG1/Pho81/XPR1) domeinen^{43 ,44,45}, sommige eiwitten interactie met IPS of pi’s door mechanismen die onbekend blijven. Bijvoorbeeld, de repressor-Activator proteïne 1 (RAP1) van T. brucei mist canonieke Pi-bindende domeinen maar communiceert met PI (3, 4, 5) P3 en controle transcriptie van genen die betrokken zijn bij antigene variatie³. Affiniteits chromatografie en massaspectrometrie analyse van IP-of pi-interactie eiwitten van trypanosome, gist of zoogdiercellen identificeerden verschillende eiwitten zonder bekende IP-of pi-bindende domeinen^{8,46, 47}. de gegevens suggereren aanvullende niet-gekarakteriseerde proteïne-domeinen die aan deze metabolieten binden. Vandaar dat de identificatie van eiwitten die interageren met IPs of Pi’s nieuwe mechanismen van eiwit-metaboliet interactie en nieuwe cellulaire regelgevende functies voor deze kleine moleculen kunnen onthullen.

De hier beschreven methode maakt gebruik van affiniteits chromatografie gekoppeld aan westerse blotting of massaspectrometrie om eiwitten te identificeren die aan IPs of Pi’s binden. Het maakt gebruik van biotinyleerd IPS of pi’s die ofwel kruislings gekoppeld aan streptavidine geconjugeerd aan agarose kralen of als alternatief, gevangen via streptavidine-geconjugeerde magnetische kralen (Figuur 1). De methode biedt een eenvoudige workflow die gevoelig, niet-radioactief, liposoom vrij en is geschikt voor het opsporen van de binding van eiwitten uit cel lysaten of gezuiverde eiwitten³ (Figuur 2). De methode kan worden gebruikt in etiket vrij^8,46 of gekoppeld aan aminozuur-gelabelde kwantitatieve massaspectrometrie⁴⁷ om IP-of pi-bindende eiwitten van complexe biologische monsters te identificeren. Vandaar, deze methode is een alternatief voor de weinige methoden die beschikbaar zijn voor het bestuderen van de interactie van IPS of pi’s met cellulaire eiwitten en zal helpen bij het begrijpen van de regelgevende functie van deze metabolieten in trypanosomen en misschien andere eukaryoten.