אינטרטל הדמיה של לימפוציטים תוך-אפיתל במעי קטן מוריין
Summary
אנו מתארים שיטה כדי להמחיש gfp γδ iels התווית באמצעות הדמיה intravital של המעי הדק מורטין על ידי מיקרוסקופית הפוכה דיסק מיקרוסקופ קונפוקלית. טכניקה זו מאפשרת מעקב של תאים חיים בתוך רירית עד 4 h והוא יכול לשמש כדי לחקור מגוון של אינטראקציות מעיים החיסונית-אפיתל.
Abstract
לימפוציטים תוך-אפיתל המבטאת קולטן תא T γδ (γδ אל) לשחק תפקיד מפתח במעקב החיסונית של אפיתל המעי. בשל היעדר ליגולי מוחלט עבור קולטן התא γδ T, ההבנה שלנו של התקנה של γδ הפעלה של אל-על ותפקידם בvivo נשאר מוגבל. זה מחייבת את ההתפתחות של אסטרטגיות חלופיות לחקור משעולים איתות המעורבים בוויסות הפונקציה של γδ, ואת התגובה של תאים אלה למיקרו הסביבה המקומית. למרות γδ IELs מובנים באופן נרחב כדי להגביל טרנסלוקציה הפתוגן, השימוש הדמיה in, היה קריטי כדי להבין את הדינמיקה הרקתית של האינטראקציות של אל-האו אפיתל במצב יציב בתגובה פתוגנים פולשנית. בזאת, אנו מציגים פרוטוקול להמחיש התנהגות הנדידה של אל-אל ברירית המעי הקטן של העכבר הכתבת gfp γδ T באמצעות דיסק מסתובב הפוך מיקרוסקופ לייזר קונפוקלית. למרות שעומק ההדמיה המקסימלי של גישה זו מוגבל ביחס לשימוש במיקרוסקופיה לייזר בשני הפוטונים, מיקרוסקופ לייזר מסתובב בדיסק מספק את היתרון של רכישת תמונה במהירות גבוהה עם הלבנת שיפור ו נזקי. באמצעות תוכנת ניתוח התמונה 4D, התנהגות מעקב התא T ואת האינטראקציות שלהם עם התאים השכנים ניתן לנתח בעקבות מניפולציה ניסיוני כדי לספק תובנה נוספת לתוך הפעלה ותפקוד של אל-על בתוך רירית המעי.
Introduction
לימפוציטים התוך-אפיתל (אל-על) נמצאים מתחת לאפיתל המעי, ומצויים הן לאורך קרום המרתף ובין תאי האפיתל הסמוכים בחלל הבין-תאי הרוחבי1. יש כ-א. א. אחד עבור כל 5-10 תאים אפיתל; אלה IELs לשמש זקיפים כדי לספק מעקב החיסונית של המרחב הגדול של מכשול האפיתל המעי2. IELs ביטוי קולטן התא γδ T (TCR) מהווים עד 60% של אוכלוסיית הכולל של אל. אל במעי הדק קטן. מחקרים ב γδ T-cell לקוי עכברים להפגין תפקיד המגן במידה רבה של תאים אלה בתגובה לפציעה במעיים, דלקת וזיהום3,4,5. למרות הדור של העכבר הנוקאאוט Tcrd 6, ההבנה שלנו של ביולוגיה γδ, שנותרה מוגבלת בשל העובדה שליטרים המוכרים על-ידי הγδ tcr טרם זוהו7. כתוצאה מכך, חוסר כלים ללמוד את האוכלוסיה הסלולרית התקשה לחקור את התפקיד של γδ TCR הפעלה ותפקוד בתנאים פיסיולוגיים ופתולוגיים. כדי למלא פער זה, פיתחנו טכניקות הדמיה בשידור חי כדי להמחיש את התנהגות הנדידה הγδ של אל-על עם הסביבה השכנה כאמצעי כדי לספק תובנה נוספת לפונקציה γδ והיענות לגירויים חיצוניים בvivo.
במהלך העשור האחרון, הדמיה מעמיקה הרחיבה באופן משמעותי את הבנתנו את האירועים המולקולריים המעורבים בהיבטים מרובים של ביולוגיה של המעי, כולל תאים אפיתל הקזת8, ויסות פונקציית ההפרדה האפיתל9 ,10, לדגימת תא מיאלואידית של תוכן של לומיאל11,12, ואינטראקציות של חיידק מארח11,13,14,15,16 . במסגרת השימוש בביולוגיה של אל-על, שימוש במיקרוסקופיה באמצעות מיקרוטרטל מזיל אור על הדינמיקה הטמפורלית של אל-מדינת אל-עואו, והגורמים המאובטים את התנהגות המעקב שלהם13,14,15, . שישה עשרה הפיתוח של TcrdH2BeGFP (tcrdegfp) כתבת עכברים, אשר תוויות γδ iels על ידי גרעיני הביטוי gfp17, גילה כי iels γδ הם מאוד נעים בתוך האפיתל והתערוכה התנהגות ייחודית מעקב היענות חיידקים . זיהום17,13,14 לאחרונה, עוד γδ T העיתונאי הנייד פותחה (Tcrd-gdl) אשר מבטא gdl בציטופלסמה כדי לאפשר ויזואליזציה של התא כולו18. מתודולוגיה דומה שימש כדי לחקור את הדרישה של קולטני כימוקין ספציפיים, כגון G חלבון בשילוב קולטן (gpcr)-18 ו-55, על הדינמיקהשל אל. בהעדר כתב מיוחד לתאים, השתמשו בנוגדנים בעלי מראות פלורסנט כנגד CD8α שימשו להמחיש ולעקוב אחר “אל-לvivo” ב-19,20. למרות מיקרוסקופ שני פוטון לייזר סריקה משמש בדרך כלל עבור הדמיה intravital, השימוש של הדיסק ספינינג מיקרוסקופ לייזר קונפוקלית וקד מספק יתרונות ייחודיים כדי ללכוד מהירות גבוהה ברזולוציה גבוהה multi-channel תמונות עם רעש רקע מינימלי. טכנולוגיה זו היא אידיאלית כדי להבהיר את הדינמיקה הטמפורלית של אינטראקציות החיסון/אפיתל בתוך המיקרו-סביבה המורכבת של רירית המעי. יתר על כן, באמצעות שימוש במודלים שונים ו/או העכבר מודלים, מחקרים אלה יכולים לספק תובנה לתוך הוויסות המולקולרי של המעי החיסונית ו/או תא אפיתל התפקוד.
Protocol
Representative Results
Discussion
פיתוח טכניקות המיקרוסקופיה של הארגון סיפק הזדמנות חסרת תקדים לבחון את התארגנות משנה של מבנים תת-תאיים8,9,22, אינטראקציות תא תאים12, 25 והתנהגות הנדידה של תאים13,14,<sup class="xref…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת על ידי NIH R21 AI143892, ניו ג’רזי קרן הבריאות גרנט, בוש ביורפואי מענק (קל). אנו מודים למדלן הו על עזרתה בעריכת כתב היד והענקת הנתונים המוצגים בתוצאות הנציגים.
Materials
| 35mm dish, No. 1.5 Coverslip | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| Alexa Fluor 633 Hydrazide | Invitrogen | A30634 | |
| BD PrecisionGlide Hypodermic needles – 27g | Thermo Fisher Scientific | 14-826-48 | |
| BD Slip Tip Sterile Syringe – 1 ml | Thermo Fisher Scientific | 14-823-434 | |
| BD Tuberculin Syringe | Thermo Fisher Scientific | 14-829-9 | |
| Dissecting scissors | Thermo Fisher Scientific | 08-940 | |
| Electrocautery | Thermo Fisher Scientific | 50822501 | |
| Enclosed incubation chamber | OKOLAB | Microscope | |
| Eye Needles, Size #3; 1/2 Circle, Taper Point, 12 mm Chord Length | Roboz | RS-7983-3 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Sigma-Aldrich | 55037C | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | |
| Imaris (v. 9.2.1) with Start, Track, XT modules | Bitplane | Software | |
| Inverted DMi8 | Leica | Microscope | |
| IQ3 (v. 3.6.3) | Andor | Software | |
| Ketamine | Putney | Anesthesia | |
| Kimwipes | VWR | 21905-026 | |
| McPherson-Vannas scissors 3” (7.5 cm) Long 5X0.15mm Straight Sharp | Roboz | RS-5600 | |
| Non-absorbable surgical suture, Silk Spool, Black Braided | Fisher Scientific | NC0798934 | |
| Nugent Forceps 4.25” (11 cm) Long Angled Smooth 1.2mm Tip | Roboz | RS-5228 | |
| Puralube Vet Ointment | Dechra | Lubricating Eye Ointment | |
| Spinning disk Yokogawa CSU-W1 with a 63x 1.3 N.A. HC PLAN APO glycerol immersion objective, iXon Life 888 EMCCD camera, 405 nm diode laser, 488 nm DPSS laser, 640 nm diode laser | Andor | Confocal system | |
| Xylazine | Akorn | Anesthesia |
References
- Cheroutre, H., Lambolez, F., Mucida, D. The light and dark sides of intestinal intraepithelial lymphocytes. Nature Reviews Immunology. 11 (7), 445-456 (2011).
- Hu, M. D., Edelblum, K. L. Sentinels at the frontline: the role of intraepithelial lymphocytes in inflammatory bowel disease. Current Pharmacology Reports. 3 (6), 321-334 (2017).
- Chen, Y., Chou, K., Fuchs, E., Havran, W. L., Boismenu, R. Protection of the intestinal mucosa by intraepithelial gamma delta T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 99 (22), 14338-14343 (2002).
- Swamy, M., et al. Intestinal intraepithelial lymphocyte activation promotes innate antiviral resistance. Nature Communications. 6, 7090 (2015).
- Dalton, J. E., et al. Intraepithelial gammadelta+ lymphocytes maintain the integrity of intestinal epithelial tight junctions in response to infection. Gastroenterology. 131 (3), 818-829 (2006).
- Mombaerts, P., et al. Spontaneous development of inflammatory bowel disease in T cell receptor mutant mice. Cell. 75 (2), 274-282 (1993).
- Willcox, B. E., Willcox, C. R. gammadelta TCR ligands: the quest to solve a 500-million-year-old mystery. Nature Immunology. 20 (2), 121-128 (2019).
- Marchiando, A. M., et al. The epithelial barrier is maintained by in vivo tight junction expansion during pathologic intestinal epithelial shedding. Gastroenterology. 140 (4), e1201-e1202 (2011).
- Marchiando, A. M., et al. Caveolin-1-dependent occludin endocytosis is required for TNF-induced tight junction regulation in vivo. Journal of Cell Biology. 189 (1), 111-126 (2010).
- Yu, D., et al. MLCK-dependent exchange and actin binding region-dependent anchoring of ZO-1 regulate tight junction barrier function. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 107 (18), 8237-8241 (2010).
- Chieppa, M., Rescigno, M., Huang, A. Y., Germain, R. N. Dynamic imaging of dendritic cell extension into the small bowel lumen in response to epithelial cell TLR engagement. Journal of Experimental Medicine. 203 (13), 2841-2852 (2006).
- McDole, J. R., et al. Goblet cells deliver luminal antigen to CD103+ dendritic cells in the small intestine. Nature. 483 (7389), 345-349 (2012).
- Edelblum, K. L., et al. Dynamic migration of gammadelta intraepithelial lymphocytes requires occludin. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 109 (18), 7097-7102 (2012).
- Edelblum, K. L., et al. gammadelta Intraepithelial Lymphocyte Migration Limits Transepithelial Pathogen Invasion and Systemic Disease in Mice. Gastroenterology. 148 (7), 1417-1426 (2015).
- Hu, M. D., et al. Epithelial IL-15 Is a Critical Regulator of gammadelta Intraepithelial Lymphocyte Motility within the Intestinal Mucosa. Journal of Immunology. 201 (2), 747-756 (2018).
- Hoytema van Konijnenburg, D. P., et al. Intestinal Epithelial and Intraepithelial T Cell Crosstalk Mediates a Dynamic Response to Infection. Cell. 171 (4), 783-794 (2017).
- Prinz, I., et al. Visualization of the earliest steps of gammadelta T cell development in the adult thymus. Nature Immunology. 7 (9), 995-1003 (2006).
- Sandrock, I., et al. Genetic models reveal origin, persistence and non-redundant functions of IL-17-producing gammadelta T cells. Journal of Experimental Medicine. 215 (12), 3006-3018 (2018).
- Wang, X., Sumida, H., Cyster, J. G. GPR18 is required for a normal CD8alphaalpha intestinal intraepithelial lymphocyte compartment. Journal of Experimental Medicine. 211 (12), 2351-2359 (2014).
- Sumida, H., et al. GPR55 regulates intraepithelial lymphocyte migration dynamics and susceptibility to intestinal damage. Sci Immunol. 2 (18), (2017).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harbor Protocols. 2 (2), (2011).
- Watson, A. J., et al. Epithelial barrier function in vivo is sustained despite gaps in epithelial layers. Gastroenterology. 129 (3), 902-912 (2005).
- Lodolce, J. P., et al. IL-15 receptor maintains lymphoid homeostasis by supporting lymphocyte homing and proliferation. Immunity. 9 (5), 669-676 (1998).
- Ma, L. J., Acero, L. F., Zal, T., Schluns, K. S. Trans-presentation of IL-15 by intestinal epithelial cells drives development of CD8alphaalpha IELs. Journal of Immunology. 183 (2), 1044-1054 (2009).
- Knoop, K. A., et al. Antibiotics promote the sampling of luminal antigens and bacteria via colonic goblet cell associated antigen passages. Gut Microbes. 8 (4), 400-411 (2017).
- Sujino, T., et al. Tissue adaptation of regulatory and intraepithelial CD4(+) T cells controls gut inflammation. Science. 352 (6293), 1581-1586 (2016).
- Zhang, B., et al. Differential Requirements of TCR Signaling in Homeostatic Maintenance and Function of Dendritic Epidermal T Cells. Journal of Immunology. 195 (9), 4282-4291 (2015).
- Chennupati, V., et al. Intra- and intercompartmental movement of gammadelta T cells: intestinal intraepithelial and peripheral gammadelta T cells represent exclusive nonoverlapping populations with distinct migration characteristics. Journal of Immunology. 185 (9), 5160-5168 (2010).
- Kolesnikov, M., Farache, J., Shakhar, G. Intravital two-photon imaging of the gastrointestinal tract. Journal of Immunological Methods. 421, 73-80 (2015).
