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环境科学

Manipulación de patrones de color en arañas saltarines para uso en experimentos conductuales

Published: May 21, 2019
doi:
10.3791/59824
,
1Department of Entomology and Nematology,University of Florida, 2Florida Museum of Natural History,University of Florida

Summary

El objetivo de este protocolo es manipular los patrones de color de las arañas saltarines y otros artrópodos muy pequeños con pintura para estudiar cuestiones relacionadas con la selección sexual, el canibalismo sexual, la depredación, el Aposematismo o cualquier otro campo de coloración animal.

Abstract

En el campo de la ecología conductual, muchos experimentos están diseñados para investigar los propósitos evolutivos de los rasgos coloridos en el contexto de la selección sexual y la depredación. Los métodos son varios, pero en su mayoría consisten en la modificación de los patrones de color de las personas con diversos colorantes. Estas técnicas se han utilizado en muchos taxones de vertebrados, particularmente en las aves, pero se han mantenido subdesarrolladas para los invertebrados debido a la dificultad de manipular eficazmente el color en los pequeños organismos. En cambio, para manipular la apariencia de los invertebrados, los científicos generalmente han modificado el entorno de iluminación para filtrar ciertas longitudes de onda. Sin embargo, un método de este tipo afecta no sólo el rasgo fenotífico de interés, sino toda la apariencia del individuo y sus alrededores. Aquí, la reducción de las técnicas utilizadas anteriormente en las aves coloridas, presentamos formas de manipular los colores de los pequeños artrópodos, utilizando especies igualmente emblemáticas pero subestudiadas: las coloridas arañas saltarines.

Introduction

Los animales a menudo tienen patrones de color elaborados que se exhiben durante encuentros sexuales, encuentros agonistas o para disuadir la depredación. Estos rasgos pueden transmitir información a receptores como la calidad individual del señador como pareja1, habilidad de lucha como competidor2, o palatabilidad como objeto de presa3. Para entender los propósitos adaptables de los rasgos coloridos, los investigadores han diseñado experimentos que implican la manipulación de colores de varias maneras. Algunos investigadores han utilizado estímulos señuelo de colores tales como los modelos4,5,6,7,8, fotografías9, o videos10,11, 12 que se presentan a los receptores en experimentos conductuales. Otros, especialmente al usar invertebrados, han manipulado el ambiente de iluminación para afectar la apariencia de los colores de individuos vivos13,14,15,16, 17. todas estas manipulaciones, aunque ingeniosas, tienen la desventaja de eliminar el comportamiento natural potencialmente importante y/o afectar mucho más que el rasgo de interés. En los grandes vertebrados, como las aves, los investigadores a menudo manipulan el color directamente en animales vivos (revisados en Hill y McGraw, 200618). Las plumas o picos individuales han sido coloreados directamente con los marcadores2,19,20,21,22,23,24, colorantes que contienen peróxido de hidrógeno a menudo utilizado en los aclaradores de pelo25,26,27, o varias pinturas incluyendo esmalte de uñas28. En los invertebrados, tales estudios que manipulan patrones de color directamente en animales vivos son comparativamente raros, pero todavía han proporcionado una inmensa visión de la función y evolución del color29,30,31 ,32,33,34,35,36,37,38,39. Incluso los estudios de artrópodos parecen ser tendenciosos hacia grandes taxas que se pueden manejar y pintar más fácilmente, dejando patrones de color en especies muy pequeñas relativamente poco estudiadas.

Aquí describimos una delicada técnica de manipulación de color que fue desarrollada para pequeños taxa de animales. Específicamente, este método implica manipular la coloración facial de las arañas macho que saltan bajo un microscopio con el fin de investigar la importancia de tales rasgos coloridos en el contexto de la elección del mate y el canibalismo sexual. En este caso, hemos utilizado Habronattus pyrrithrix (recolectado de Phoenix, AZ, EE.UU.) como una especie modelo (figura 1). Hemos publicado los resultados del trabajo experimental utilizando algunas de estas técnicas en otros lugares38,39, pero aquí describimos los métodos con más detalle de lo que se ha hecho anteriormente, de una manera que debería hacerlos accesibles a otros tratando de replicarlos o adaptarlos para su uso en otros Taxa muy pequeños. Tales protocolos deben abrir oportunidades experimentales en animales que pueden ser tan coloridos como las aves más emblemáticas, pero que por lo general son poco estudiados.

Protocol

1. preparación del equipo Seleccione las pinturas apropiadas. Para una aplicación exitosa, utilice pinturas que son de secado rápido y tienen una textura que se manipula fácilmente con más delgado. Los productos que se han utilizado con éxito incluyen delineadores no impermeables que pueden ser diluido con agua, y pinturas de esmalte que se pueden simplificar con el disolvente de esmalte (tabla de materiales). Al pintar arañas, tenga en cuenta que el caparazón de la mayoría de las especies tiene un exoesqueleto endurecido, mientras que el abdomen blando a menudo se estira y contrae con la alimentación40. Las pinturas esmaltadas producen un recubrimiento sólido y endurecido sobre la superficie pintada; por lo tanto, aplíquelo sobre partes duras de la cutícula (p. ej., caparazón, patas, pedipalps). Tales recubrimientos de esmalte son menos efectivos para el abdomen de la araña, ya que se despega de la araña a medida que cambia de forma con la alimentación. Por el contrario, los delineadores no producen un recubrimiento endurecido, sino que se filtran en las escamas del cuerpo de color; como tal, utilizarlos en las partes del cuerpo duro y blando (incluyendo el abdomen de la araña).Nota: en los próximos pasos, se presenta la técnica más delicada que consiste en pintar la cara y los tejedora de las arañas; se utiliza pintura esmaltada, que es el método más generalizable debido a la diversidad cromática de pintura esmaltada disponible. Antes de probar las pinturas en animales vivos, si es posible, mida primero las propiedades espectrales de la pintura (simplemente aplicada al papel u otra superficie) utilizando un espectrofotómetro de reflectancia UV-VIS para asegurar que no haya picos UV no deseados en el espectro que sería invisible para los seres humanos, pero posiblemente visible para las especies estudiadas. Utilice un microscopio de disección conectado a una cámara y una computadora para tomar fotos más fácilmente del resultado de la manipulación para la documentación y aumentar la replicabilidad (tabla de materiales). Encienda el microscopio, el ordenador y el software que procesa la entrada de la cámara. Seleccione el zoom relevante en el que se tomará la imagen final. Pegue un alfiler de montaje de insectos o un pequeño clavo (con la cabeza apuntando hacia afuera) en una bola de arcilla de modelado no endureciendo (aproximadamente el tamaño de una uva). (La araña viva a pintar se monta temporalmente en la cabeza de este alfiler en el paso 3,1 abajo). Coloque la arcilla de modelado y el pasador debajo del microscopio para ajustar los objetivos de manera que se centren más o menos en la cabeza del pasador (donde se va a montar la araña). Asegúrese de que los objetivos están a la distancia correcta para los ojos del pintor, y que la cámara no está obstruyendo el campo de visión durante la pintura (como es el caso si la cámara está montada en uno de los oculares, obstaculizando la percepción de profundidad). Transfiera la araña a un vial de plástico limpio (alrededor de 12 drams, sin ningún tipo de correas o presas muertas). Prepare el equipo de montaje y pintura. Coloque un perno de montaje de insecto extra delgado en una bola de arcilla de modelado no endurecida (además de la utilizada en el paso 1.2.3) y colóquelo en el lado izquierdo del microscopio (para personas diestros). Este pasador se utilizará para ajustar suavemente las posiciones de las patas de la araña y los tejedora (según sea necesario) durante la pintura. Obtenga una pequeña pieza de papel absorbente (como una toalla de papel), un pedazo de papel de impresión blanco, las pinturas para aplicar (aquí, pintura de esmalte), recipientes separados de disolvente de pintura (uno para cada color más uno mantenido transparente y limpio), micro cepillos individuales para cada color (ver tabla de materiales), y un micro cepillo para ser utilizado sólo con disolvente limpio, todos colocados de una manera organizada a la derecha del microscopio (para las personas diestros). Con un palillo de dientes, añadir una gota de pintura en un recipiente de plástico abierto (como una pequeña placa de Petri o una tapa del vial) y Añadir disolvente de pintura, por ejemplo, con una pequeña jeringa. Mezclar los dos con el palillo de dientes a la consistencia correcta (cuando la pintura está completamente homogeneizada, pero no demasiado escurridiza) mediante la prueba en el papel de la impresora blanca con un micro cepillo.Nota: en ciertos casos, si la pintura se seca rápidamente, prepáresela con un poco más de líquido que la deseada para la aplicación, y deje que los cepillos se sumerja en la olla de disolvente de pintura hasta su uso posterior (paso 4). Coloque una gota de pegamento a base de agua (vea la tabla de materiales) en una esquina del papel de la impresora.Nota: esta debe ser la última etapa de la preparación y el siguiente paso debe suceder inmediatamente después de esto, para que el pegamento no se seque. 2. anestesiando la araña Con la araña en el vial y una mano cortada sobre la abertura para evitar la fuga, agregue lentamente el gas CO2 hasta que el tercer par de patas de la araña se extienda a 180 grados. Utilice un tiempo de exposición al CO2 de aproximadamente 20 segundos a 1,5 minutos, dependiendo del tamaño medio de la especie y de la araña individual. Hemos encontrado la extensión del tercer par de patas para ser un indicador fiable del nivel adecuado de anestesia en H. pyrrithrix, pero esto probablemente varía entre las especies. Si el uso de estas técnicas con una especie diferente por primera vez, primero probar la anestesia en unos pocos especímenes para evaluar su respuesta. Dar a las arañas tan poco CO2 como sea posible para lograr el nivel necesario de anestesia. Mientras que los cortos periodos de anestesia descritos aquí no produjeron mortalidad (y no hay diferencias conductuales notables de las arañas no anestesiadas), dé a todos los animales en un experimento los mismos niveles de anestesia (incluyendo controles simulados). Mantener el vial cerrado después de agregar el CO2 para mantener la araña bajo anestesia; por lo tanto, incluir este tiempo al calcular cuánto tiempo la araña se expone a CO2. Una vez que la araña ha sido removido del vial para comenzar a manipular el color, estará completamente anestesiado durante aproximadamente 1 a 2 minutos; por lo tanto, realice los siguientes pasos (secciones 3-6) de inmediato. Debido a esta ventana de tiempo limitado, intente el siguiente método de pintura con especímenes muertos primero (para la práctica) antes de intentar pintar arañas vivas. 3. montaje de la araña bajo el microscopio Añadir una cantidad muy pequeña de pegamento sobre la cabeza del pasador de montaje o uña en la arcilla de modelado preparada en el campo de visión del microscopio.Nota: Utilice la cantidad más pequeña de pegamento que permite mantener la araña en su lugar para asegurarse de que i) la araña no se deslice fuera de la cabeza de alfileres (si se utiliza demasiada cola), y II) la araña logra liberarse a sí mismo después de despertar. Deslice suavemente la araña anestesiada de su vial sobre la mesa con el lado ventral hacia arriba.Nota: debido a que los abdómenes de las arañas son blandos, se debe tener cuidado de no tocar ni dejar caer las arañas sobre la mesa, ya que esto puede causar lesiones. Presione suavemente la cabeza de alfileres (con pegamento) en el esternón de la araña (el área central donde las piernas de la araña se unen al cuerpo) de tal forma que la araña rebota ligeramente y extienda sus piernas bajo la pequeña presión aplicada. Para un control adicional de la presión aplicada, sostenga la arcilla de modelado con ambas manos, teniendo ambas manos aceradas firmemente contra la mesa. Reposicione la arcilla de modelado bajo el microscopio para que el área a pintar esté orientada hacia arriba y enfocada. 4. pintar la araña Evalúe la consistencia de la pintura antes de tocar el pincel a la araña. Vuelva a probar la consistencia de la pintura (utilice el papel absorbente para limpiar los cepillos Si se mantuvieron en el diluyente), ajuste de nuevo si es necesario, y siempre primero intente aplicar pintura en el papel de la impresora para controlar la cantidad de pintura contenida en los pelos del pincel. Con la mano derecha y mirando a través del microscopio, llevar la punta de la brocha en el campo de visión, y asegúrese de (una segunda vez) que los pelos del cepillo no contienen demasiada pintura, en cuyo caso Limpie parte de ella en el papel de la impresora. Prueba la consistencia de la pintura en la araña. Toque la araña con el cepillo en el área más grande que tendrá que ser pintado sobre. Esto informará al pintor si la consistencia y la cantidad de pintura es correcta (esdecir, cuando la pintura se absorbe ligeramente y lentamente en el cabello/escamas de la araña). Si no se aplica ninguna pintura, sumerja el pincel en la pintura y regrese al paso 4,1 para repetir el procedimiento. Si la pintura se absorbe rápidamente y se derrama sobre un área que no debe ser cubierta por la pintura, y suponiendo que el derrame es mínimo y que el individuo todavía podría participar en el experimento, limpie el cepillo en el papel absorbente y regrese al paso 4,1 para repetir el procedimiento.Nota: este tipo de derrame líquido no se puede fijar. Si el derrame llega a las quelíceros o a los ojos, u otras partes que podrían ser letales o tóxicas para el individuo, considere colocar la araña inmediatamente en el congelador para eutanzar antes de que se despierte y excluya a la araña del experimento. Pinte todas las áreas que necesitan colores siguiendo los pasos 4,1 y 4,2. Si pintas la cara de la araña, usa el alfiler extra delgado con la mano izquierda para mantener las patas delanteras y los tejedora (para que estén fuera del camino de la brocha). Esto se hace mejor al mirar a través del microscopio para evitar dañar los apéndices de la araña. Además, si pintar la cara de la araña, y dependiendo de los cepillos utilizados para pintar, considere la posibilidad de pintar ambos lados de la cara antes de tratar de pintar la parte central entre los ojos-ambas áreas pintadas se pueden unir sosteniendo el pincel paralelo a la cara de la araña e inducir la acción capilar.Nota: al pintar la cara de la araña, es más fácil pintar primero el lado más cercano a la mano dominante, y luego rotar la bola de arcilla (con la araña montada) alrededor debajo del microscopio para pintar el otro lado, seguido por el medio. Al pintar tejedora o piernas, asegúrese de no tocar ninguna articulación si la pintura es un endurecimiento (como la pintura de esmalte), y asegúrese de no aplicar pintura a los órganos de entrega de esperma del macho (en la parte inferior del segmento distal de los tejedora). 5. tomando la imagen de la araña Cambie el objetivo al modo de cámara. Tome una foto utilizando el software del ordenador, asegurándose de que el zoom seleccionado es el elegido en el microscopio, para que se pueda añadir una barra de escala. 6. liberando la araña de la clavija o uña Cuando la araña comienza a moverse, sostenga el pasador para que las patas delanteras de la araña toquen el vial de la araña. Deja que la araña se libere, y si es necesario, inclina suavemente el alfiler para ayudar a la araña a alejarse del pegamento seco. Si la araña se despierta antes de que se complete la pintura, permita que la araña al menos 15 minutos se recupere antes de ser anestesiada de nuevo. Si esto se hace, asegúrese de que todos los grupos reciben los mismos niveles de anestesia (incluyendo individuos tratados con farsa, si corresponde).Nota: las arañas parecen reanudar su comportamiento normal rápidamente después de la manipulación (< 15 minutos), pero recomendamos estandarizar el tiempo de reposo de 12 horas antes de usar la araña en una prueba conductual. 7. análisis del comportamiento de las arañas Compare el comportamiento de sujetos no manipulados, tratados con farsa y manipuladas para evaluar la posible toxicidad de la aplicación (que puede variar según el tipo de pintura específico, el color, el área de aplicación y las especies de estudio). El comportamiento relevante a comparar podría incluir la tasa de actividad, el tipo de actividad realizada, el éxito en la realización de actividades específicas (por ejemplo, capturar presas), etc. Utilizar arañas tratadas con Sham como parte del diseño experimental (por ejemplo, recibir la aplicación de pintura en un área no visible o tener pinturas de color neutro aplicadas a las mismas áreas) con el fin de cambiar sólo el color de la persona, mientras que el control de otros factores (p. ej., tiempo de manipulación, olor, textura superficial, etc.).Nota: si pinta patas o pedipalps, considere la posibilidad de que esto pueda interferir con los pelos sensoriales (prevalente sobre las patas de araña y los pedipalps, véase Foelix 201040) y, en estos casos, los machos con tratamiento falso deben tener pinturas de color neutro aplicadas a la mismas áreas que un control. Al desarrollar nuevos métodos, compare las arañas pintadas con arañas no manipuladas para evaluar si los individuos manipulados por color siguen comportándose normalmente. 8. medición de las propiedades reflectancia de la manipulación del color en el sujeto pintado Una vez eutanasia (después de que las arañas estuvieran involucradas en un experimento o específicamente eutanasia para este propósito, vea la nota a continuación), mida las propiedades espectrales de la manipulación del color utilizando un espectrofotómetro portátil UV-VIS estándar (tabla de materiales ), especialmente para superficies de más de 1 mm de diámetro. Para áreas más pequeñas, utilice un microespectrofotómetro personalizado (un espectrofotómetro UV-VIS enrutado a través de un microscopio) para mediciones más fáciles y precisas, aunque la óptica del microscopio recorte la luz UV, lo que significa que las mediciones se limitan a la longitudes de onda visibles para el ser humano (véase Taylor et al. 201141). En los casos en que las áreas manipuladas por color sean extremadamente pequeñas y se requieran datos de reflectancia UV, utilice microespectrofotómetros UV-VIS disponibles comercialmente, aunque son más caros (véase Taylor et al. 201442).Nota: la fuente de luz de los espectrofotómetros UV-VIS contiene luz UV y puede ser peligrosa para los ojos de los animales (incluido el nuestro), por lo que las medidas espectrales sólo deben realizarse después de que los animales son sacrificados y no simplemente anestesiados. Para las arañas pintadas de esmalte, esto se puede hacer después de que las arañas se han utilizado en experimentos ya que la pintura no se desgastan (ver resultados representativos a continuación). Para la pintura a base de agua que a veces puede desvanecerse después de días o semanas, un conjunto de arañas podría ser sacrificado para la medición en el momento en que su contraparte estaría involucrado en un experimento (para capturar datos que reflejan la manipulación de color real utilizada en el experimento). Informar de las propiedades espectrales de las pinturas permitirá la replicación por otros investigadores que pueden querer replicar la manipulación de color, pero no tienen acceso a los mismos productos de pintura específicos.

Representative Results

Efectividad de la manipulación de color Usando estas técnicas, varios grados de manipulación del color son efectivos, incluyendo ocultar los colores completamente o reducir o mejorar su intensidad. Esto es evidente tanto en las fotografías como en las mediciones de la reflectancia espectral (figura 2, figura 3y figura 4). Aquí mostramos el macho Habronattus pyrrithrix , manipulado por color, comparado con los machos de cara roja natural. Las propiedades espectrales se midieron utilizando un espectrofotómetro UV-VIS (ver tabla de materiales) que puede medir con precisión las áreas de color tan pequeñas como 1mm de diámetro. Las mediciones se tomaron en relación con un estándar blanco de reflectancia difusa (ver tabla de materiales). En raras ocasiones (5 de 108 hombres pintados con delineador de ojos negro 1 (ver tabla de materiales) en su cara), el delineador de ojos soluble en agua comenzó a desgastarse las caras de las arañas después de una semana o dos. Esto no se observó para la otra marca de delineador de ojos (delineador de ojos 2; ver tabla de materiales). En ambos casos, las jaulas de araña fueron rociados con agua de tres a cinco veces por semana. Las diferentes condiciones de mantenimiento pueden afectar al desgaste de la pintura a base de agua. La pintura de esmalte seguía intacta para todos los machos manipulados (n = 221), incluso para los que aún viven después de 6 meses. La posible toxicidad de la manipulación del color Uno debe evitar obtener pintura en los ojos de las arañas para no obstruir su visión, ni en sus chelicerae, partes de la boca y otros orificios, y posiblemente otras partes del cuerpo blando para evitar la posible ingestión y envenenamiento. También se debe tener cuidado con la pintura de las articulaciones o partes que contienen pelos sensoriales (como las piernas y los pedipalps) para no restringir su movilidad o sistema sensorial. Sin embargo, si tales manipulaciones de color en estas regiones del cuerpo son necesarias, o si hay alguna duda sobre la posibilidad de efectos negativos sutiles, entonces es mejor aplicar pinturas a individuos en todas las categorías de tratamiento. De esta manera, uno evitaría manipular involuntariamente los sistemas sensoriales de las personas de maneras que podrían estar sesgadas contra uno de los tratamientos solamente. Por ejemplo, en un experimento con machos manipulados que se muestran en la figura 4, el objetivo era aumentar y disminuir el número de parches rojos mostrados por los machos durante el cortejo. Dado que algunos machos tendrían sus caras rojas naturales ocultas con pintura de esmalte gris (para disminuir la cantidad de rojo mostrado), los otros machos para los que queríamos mantener una cara roja fueron pintados de rojo sobre su cara de color rojo natural con el mismo producto que el gris Machos. Del mismo modo, ya que queríamos añadir parches rojos al pedipalpo en ciertos machos para aumentar la cantidad de parches de color rojo mostrados, se usó pintura gris para cubrir el pedipalpo de otros machos para que todos los machos fueran pintados en esta área sensible (ver figura 4) . Aunque es preferible, esta estrategia puede no ser siempre factible. Por ejemplo, en otro experimento, la coloración roja se eliminó mediante el uso de un delineador de ojos negro que daba la misma propiedad espectral que la cutícula subyacente del macho, dejando los otros colores masculinos intactos y naturales (figura 2). En este caso, para los machos de aspecto natural, la misma cantidad de delineador de ojos se aplicó a la zona en la parte superior de su caparazón justo detrás de su ojo mediano anterior (un área que no es claramente visible para las hembras), para controlar el olor potencial o la toxicidad general de la Producto. Sin embargo, la ubicación donde se aplica la pintura puede afectar a las arañas de manera diferente. Por lo tanto, para evaluar las diferencias sutiles en el camino o la ubicación donde se aplicó la pintura puede tener sobre la integridad de la araña, el comportamiento de ambos tipos de machos en un contexto que era relevante para nuestras hipótesis (en relación con la elección de mate y el canibalismo sexual) se comparó. Los machos se pusieron dos por dos en presencia de una hembra, y comparamos su retraso para ser activos, su retraso en el corteto, y la duración total que pasaron cortantes con modelos de efectos mixtos lineales generales (utilizando la función lmer con el paquete R lme443 en la versión 3.5.244 de R con la identidad femenina como un efecto aleatorio, y utilizando el criterio de máxima verosimilitud para obtener valores p). En este caso, todas las comparaciones no revelan diferencias entre los tratamientos (véase el cuadro 1) y, por lo tanto, se concluyó que no introducimos un sesgo a favor de una u otra categoría de tratamiento. En cualquier caso, cuando se tienen categorías de tratamiento muy similares (figura 4), o sólo las personas tratadas simuladas (figura 2 y figura 3), los investigadores deben evaluar cómo sus especies modelo se ven afectadas por la pintura que utilizan y garantizar que siguen comportándose de manera similar y ecológicamente relevante. Uno podría registrar datos para evaluar los posibles efectos de la toxicidad tanto como sea posible, por ejemplo comparando las tasas de actividad entre individuos tratados y no manipulados. Nuestras arañas pintadas con pintura esmaltada como en la figura 4 se compararon con los machos no manipulados en un contexto de otro modo idéntico. Específicamente, los machos fueron introducidos individualmente a una jaula femenina y su retraso para dejar el vial, retraso de cortejamiento y cortezado (antes de la copulación, y antes de ser atacado o canibalizado) fueron comparados. No se encontraron diferencias (al usar modelos de efectos mixtos lineales similares a los anteriores) y por lo tanto llegamos a la conclusión de que nuestros machos pintados se comportaban de forma natural (tabla 2). Por último, es importante tener en cuenta que cualquier arañas en los experimentos (por lo general las hembras) que canibalizados machos manipulados en color nunca parecían sufrir de efectos negativos. Las arañas digieren sus presas externamente, usualmente dejando atrás las áreas pintadas de la cutícula. Sin embargo, si se va a adaptar este método para otros sistemas en los que se consuman animales manipulados por colores, se deben evaluar los posibles riesgos de toxicidad. Figura 1 . El macho adulto Habronattus pyrrithrix ilustra cuán diminutas son sus regiones corporales de color. Fotografiado por Lyle Buss. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 2 . Manipulación de color experimental utilizada para ocultar la coloración facial roja en Habronattus pyrrithrix. (A) la coloración facial roja intacta antes de la manipulación del color. (B) la coloración facial del mismo macho después de ocultar la coloración roja natural con delineador de ojos negro 1. (C) espectros de reflectancia representativos para la cara roja natural, la cutícula negra subyacente natural, y la cara roja pintada con delineador de ojos negro 2. Modificado de Taylor y McGraw 201339. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 3 . La manipulación experimental del color se utiliza para reducir el tamaño y el enrojecimiento del parche facial rojo del macho Habronattus pyrrithrix. (A) la coloración facial roja intacta antes de la manipulación del color. (B) la coloración facial del mismo macho después de aplicar delineador negro diluido (Urban Decay) a la parte frontal de la cara, y delineador de ojos negro no diluido a lo largo de los bordes del parche facial para reducir el tamaño de la zona roja. (C) la media de las curvas espectrales de los machos de control tratados con farsa (n = 21) y los machos manipulados en color (n = 21), en comparación con la media de la población (n = 57) y los 10 machos drabbest de un estudio anterior41. Figura reproducida de Taylor et al. 201438. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 4 . Manipulación de color experimental utilizada para modificar el color del parche facial rojo del macho Habronattus pyrrithrix. Habronattus pyrrithrix machos pintados con (a) rojo, (B) rojo y gris, y (C) pintura de esmalte gris sobre su cara roja natural y pedipalps naturalmente de color crema. (D) media de las curvas espectrales de los machos no manipulados (n = 9), y los machos con la cara cubierta con pintura de esmalte rojo (n = 9). Aplicando un rojo más brillante sobre la cara de la araña, aumentamos eficazmente su coloración facial roja. Debido a que la pintura de esmalte cubre completamente las escamas subyacentes, el color también se podría cambiar por completo, como es el caso con el esmalte gris. (E) en este experimento, las pinturas de esmalte rojo y gris fueron elegidas para ser igualadas para el brillo total (reflectancia total sobre el rango de longitudes de onda visibles para estas arañas). Las diferencias en la escala de los ejes Y en D y E se deben a diferentes técnicas (como la distancia a la muestra y el tamaño de las áreas medidas) para medir las muestras de color en el papel (E) frente a las mediciones directas de los colores en la cara de la araña (D). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.  N Variable dependiente P T De cara roja ± SE De cara negra ± SE nFID 202b Retraso masculino para dejar el plato 0,35 -0,93 140,0 23,9 109,8 23,9 102 179c Retraso masculino en la corte 0,74 0,33 983,4 127,1 1031,0 126,5 95 204un El esfuerzo de cortejo masculino 0,52 0,63 181,2 24,4 203,0 24,4 102 204un El esfuerzo de cortejo masculino antes de cualquier ataque 0,41 0,68 89,0 15,7 97,5 15,7 102 Tabla 1. Efecto de la manipulación del color de la cara masculina en el comportamiento, cuando se pinta con delineador de ojos negro contra Sham tratado (figura 2). Se da la estructura de cada modelo, así como las estimaciones medias en segundos (± SE) para cada grupo de tratamiento. N = número de machos, p y t = valor p y valor t para el tratamiento masculino, nFID = el número de niveles en la identidad femenina de efecto aleatorio. una De las 104 pruebas masculinas realizadas, 102 se registraron con éxito, dando lugar a 204 machos únicos observados. b2 los machos fueron canibalizados por la hembra antes de salir de la placa de Petri. c25 varones fueron canibalizados por la hembra antes de cortetar a la hembra. N Variable dependiente P T Sin manipular ± SE Pintado ± SE 32un Retraso masculino para dejar el plato 0,87 -0,17 380,8 143,1 345,4 152,4 31b Retraso masculino en la corte 0,93 -0,09 502,6 105,8 488,1 116,6 31b El esfuerzo de cortejo masculino 0,74 -0,33 2324,3 455,0 2102,1 484,4 31b El esfuerzo de cortejo masculino antes de cualquier ataque 0,68 0,42 1495,1 450,8 1770,1 479,9 Tabla 2. Efecto de la manipulación del color de la cara masculina en el comportamiento, cuando se pinta con pintura de esmalte rojo o gris (n = 15, figura 4) frente a los machos no manipulados (n = 17). Se da la estructura de cada modelo, así como las estimaciones medias en segundos (± SE) para cada grupo de tratamiento. N = número de machos, p y t = valor p y valor t para el tratamiento masculino. un17 hombres no manipulados fueron comparados con un subconjunto de todos los machos pintados en nuestro experimento (n = 221). Concretamente, se compararon con 15 machos pintados (5 rojos (figura 2A), 5 rojos y grises (figura 2B) y 5 grises (figura 2C)) probados en el mismo contexto (en presencia de una hembra) y en el mismo período de tiempo específico. Esto es importante porque los machos no manipulados fueron probados hacia el final del experimento (en agosto y septiembre de 2018), que corresponde al final de su época de cría natural y donde los machos son generalmente menos activos. Mantener todas estas variables iguales nos permite comparar el tratamiento de pintura sin introducir otros sesgos. b Un macho (todo gris) fue canibalizado antes de cortetar a la hembra.

Discussion

Aquí, mostramos que los colores de las pequeñas partes del cuerpo de los artrópodos pueden manipularse eficazmente con colorantes como el maquillaje y las pinturas esmaltadas.

El primer paso crítico para lograr una manipulación tan delicada es poder inmovilizar a los pequeños animales que por lo general no pueden ser sujetarse en la mano. Aquí, para poder pintar áreas sensibles como la cara de la araña Saltarín, anestesiamos a individuos con CO2 y los montamos en la cabeza de un alfiler. Esto permite trabajar cerca de los ojos de la araña con menos estrés que la araña probablemente experimentaría si estuviera despierto (con la luz del microscopio brillando en sus rostros durante el proceso de pintura).

El método también requiere conseguir micro cepillos de buena calidad, y, más críticamente, sustancias colorantes apropiadas. El paso más difícil en la aplicación de la pintura sin derrames pero con una buena cobertura es obtener la consistencia correcta. Por lo tanto, las sustancias colorantes deben diluirse fácilmente con un diluyente y secarse fácilmente para espesar. Se podrían utilizar diferentes tipos de pinturas; aquí, los resultados se presentan con delineadores solubles en agua (no impermeables) y pinturas esmaltadas. Los delineadores no impermeables tienen la ventaja de ser fácilmente licuados cuando se mezclan con agua. Sin embargo, esto se negocia con la dilución de la pigmentación (que no puede o puede ser deseable (véase, por ejemplo, la figura 3)). Las pinturas esmaltadas tienen una consistencia que se puede controlar fácilmente añadiendo un disolvente de esmalte, a la vez que proporciona una cobertura completa. Sin embargo, esta característica se negocia con la posibilidad de mantener el pelo o la estructura de la escala de la parte del cuerpo pintada. Además, las pinturas esmaltadas son de larga duración. La desventaja de esto es que la pintura de esmalte y más delgado emiten olores fuertes durante la aplicación y antes del secado. Una dificultad adicional con respecto a las sustancias colorantes puede ser encontrar la sombra correcta, con las propiedades espectrales correctas. Es, por ejemplo, difícil conseguir delineador de ojos rojo para usar en paralelo con delineador de ojos negro, como los delineadores son a menudo más rosa que rojo. También es difícil conseguir polvo de maquillaje (o pigmentos) que no contienen ningún brillo (que a veces puede ser sólo visible bajo el microscopio). Muchos productos de maquillaje también reflejan la luz UV que, aunque invisible para los experimentadores, podría ser visible para los animales estudiados.

Manipular la coloración de los artrópodos aplicando directamente colorantes en sus partes del cuerpo viene con ventajas y molestias en comparación con otros métodos. Su principal limitación es que uno no puede descartar absolutamente la posibilidad de algunos efectos de toxicidad sutiles. Sin embargo, uno puede asegurarse de no introducir sesgos contra un grupo de tratamiento aplicando pintura a todas las categorías de tratamiento, y/o se puede comprobar si la aplicación de pintura interfiere con los comportamientos de interés. Con los métodos presentados aquí, recolectamos suficiente evidencia para sugerir que la aplicación de pintura llevó a un efecto insignificante o nulo (tabla 1 y tabla 2). La principal ventaja de este método es que pequeños parches de color pueden ser dirigidos, su color ‘ eliminado ‘ (ver figura 2), hecho más opaco (figura 3) o más brillante (figura 4), en aislamiento del resto de la coloración del cuerpo y el individuo Ambiente. Esto contrasta con el método alternativo más común que consiste en manipular las condiciones de iluminación, y así modificar la apariencia visual de todo el individuo y su entorno. De hecho, incluso cuando no se manipulan específicamente las condiciones de iluminación, se puede manipular con éxito el color y ver los efectos limitados o no de esta manipulación si el entorno de iluminación no es apropiado39. Por lo tanto, es importante medir y considerar el ambiente de luz donde se realizarán los experimentos (es decir, medir la irradiancia) y asegurarse de que coincida estrechamente con las condiciones de iluminación natural (por ejemplo, utilizando bombillas de espectro completo que imitan luz natural cuando está en cautiverio). En general, mediante el uso de micro cepillos y un microscopio, este protocolo permite la manipulación más precisa de pequeños parches de color que la mayoría de los otros métodos de coloración directa que se han utilizado previamente en los invertebrados. La mayoría de los estudios anteriores han utilizado animales con parches de color que son relativamente grandes en comparación con las caras de las arañas saltarinas (por ejemplo, la manipulación de los colores de ala de mariposa29,34,35, los cuerpos de adultos reduviidi (‘ verdaderos bichos ‘)30,36 y saltamontes31, o las patas de las arañas lobo relativamente grandes32,33,37). Los métodos presentados aquí abren oportunidades para estudiar la increíble diversidad de manchas de color en los taxones que están subestudiados debido a su pequeño tamaño.

Se podrían aplicar técnicas similares a otros artrópodos que pueden ser inmovilizado o anestesiado y para áreas donde la pintura no afectaría la movilidad o salud de la persona (es decir, excluyendo áreas tales como articulaciones, estructuras como el pelo o arolia que se necesitan para la locomoción, las partes de la boca u otros orificios apropiados, como las estructuras respiratorias. Estas técnicas también se pueden ampliar para incluir una paleta más grande de tintes, pinturas y maquillajes que están ampliamente disponibles.

Por último, estas delicadas técnicas podrían utilizarse no sólo para manipular el color en organismos pequeños, sino también para manipular patrones (como rayas) en organismos relativamente más grandes. Esto debe ser beneficioso para una amplia variedad de investigadores que pueden adaptar nuestros métodos a sus propios estudios de selección sexual, comunicación, señales de presa aposemática, y otros contextos en los que los animales utilizan el color.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por el financiamiento de la Fundación Nacional de Ciencias (IOS-1557867 a LAT), el Museo de historia natural de Florida, y el Departamento de Entomología y nematología en la Universidad de Florida. La cuota de publicación de este artículo fue financiada en parte por el fondo de publicación de acceso abierto de la Universidad de Florida.

Materials

CO2 tank AirGas (Radnor, PA) #CD 50 to anesthesize spiders
Enamel paint thinner Testors (Vernon Hills, IL) 75611792569 to thin enamel paint
Flat enamel paint Testors (Vernon Hills, IL) red: 075611115009, black: 075611114903, white: 075611116808 can be thinned with enamel paint thinner
Light microscope Zeiss (Jena, Germany) stemi 508 to paint small areas with precision
Light microscope camera Zeiss (Jena, Germany) Axiocam 105 color to take picture before and after manipulation for documentation
Light microscope camera software Zeiss (Jena, Germany) Zen 2 blue edition to process pictures taken before and after manipulation
Liquid liner eyeliner, shade “Perversion” Urban Decay (Costa Mesa, CA) (discontinued) non-waterproof eyeliner which can be thinned with water; eyeliner 2
MegaLiner liquid eyeliner, black WetnWild (Los Angeles, CA) SKU# 871A non-waterproof eyeliner which can be thinned with water; eyeliner 1
Micro brushes MicroMark (Berkeley Heights, NJ) #84648 to allow precise painting of small areas
Non-hardening modelling clay Van Aken International Claytoon (North Charleston, SC) 18165 to stick small nail or insect pin in and flexily adjust their angles
Small nail or insect mounting pins BioQuip (Rancho Dominguez, CA) #1208B7 to glue spiders on as well as moving away spider’s appendages in front of the area to paint
Small plastic containers such as the lids of snap-cap insect collection vials BioQuip (Rancho Dominguez, CA) #8912 to mix paint and thinner to the right consistency
Small syringe Fisher Scientific 1482910F to transfer small amount of enamel thinner
Spectralon white standard Labsphere Inc. (North Sutton, NH) WS-1-SL to measure spectral properties of colors
UV-VIS spectrophotometer Ocean Optics (Dunedin, FL) USB 2000 (spectrophotometer) with PX-2 (light source) to measure spectral properties of colors
Water soluble school glue Elmer's (High Point, NC) #E304 to mount the spiders onto a nail/pin
Wood toothpicks Up&Up, Target Corporation (Minneapolis, MN) #253-05-0125 to transfer drops of enamel paint
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Ihle, M., Taylor, L. A. Manipulation of Color Patterns in Jumping Spiders for Use in Behavioral Experiments. J. Vis. Exp. (147), e59824, doi:10.3791/59824 (2019).
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